Микробиология: Лабораторный практикум, страница 9

6.Раствор Люголя. 2г KJ растворяют в 5 мл дистиллированной воды и в этот раствор добавляют 1 г йода. Для ускорения растворения эту смесь растирают в фарфоровой ступке, после чего доливают водой до 300 мл. Используется при окраске бактерий по Граму.

Растворы красителей после изготовления фильтруют, разливают в склянки с притертыми пробками и сохраняют в темном месте. Для повседневной работы краски разливают в капельницы с притертыми пробками. Следует учитывать, что при длительном хранении растворов кристаллы краски могут выпадать в осадок, поэтому препарат рекомендуется окрашивать через полоску фильтровальной бумаги.

В лабораторной практике пользуются простыми и сложными методами окраски микробных клеток.

При простой окраске на фиксированный мазок наносят раствор какого-либо одного красителя, например, разведенного фуксина, который интенсивно окрашивает вегетативные клетки бактерий.

Сущность сложных методов окраски заключается в том, что препарат окрашивают не одной, а двумя или большим количеством красок.

Окраска по Граму

Наиболее широко в микробиологической практике применяется сложный метод окраски по Граму (пред ложен впервые в 1884 г. датским ученым X. Грамом). Метод является одним из важнейших опознаватель-ных признаков при определении вида бактерий.

Сущность метода окраски по Граму заключается в том, что все бактерии по способности окрашиваться красителями (генциан-виолет или кристаллвиолет с йодом) делятся на две группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый указанными красителями, сохраняется после обработки их спиртом. Такие клетки в результате окраски приобретают темно-фиолетовый цвет и получили название грамположительных (грамм+). Например, роды спорообразующих бактерий - Bacillus, Clostridium, среди бесспоровых – роды Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Leuconostok и др.

К другой группе относятся виды, которые не способны удерживать красящий комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными (грам-). К числу их принадлежат многие виды неспорообразующих палочковидных бактерий, в т.ч. роды Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Proteus и др.

Способность или неспособность клеток удерживать красящий комплекс в настоящее время связывают с химическим составом и структурой клеточных стенок бактерий. В оболочках грам + бактерий содержится больше гликопептида муреина, полисахаридов и тейхоевые кислоты. Они имеют достаточно плотную многослойную структуру. В клетках грам + бактерий генциан-виолет и йод образуют прочное соединение с цитоплазмой, которое не извлекается спиртом. Они сохраняют фиолетовый цвет генциан виолета и при дополнительном окрашивании фуксином Пфейффера.

Оболочки грам-бактерий однослойны, в них отмечено высокое содержание липидов в виде липопргеидов и липополисахаридов. Грам-бактерии при обработке спиртом обесцвечиваются, т.к. у них генциан-виолет не фиксируется в цитоплазме. При дополнительном окрашивании фуксином клетки бактерий окрашиваются только в бледнорозовый цвет.

Грам + отличаются от грам - не только своим отношением к окраске, но и рядом биологических свойств и особенностей. Большинство грам + видов обладают повышенной устойчивостью к обезвоживанию, термической обработке, радиоактивным и другим типам излучений. В тоже время грам -бактерии более устойчивы к действию щелочей и протеолитических ферментов, а также антибиотиков.

Окраску по Граму используют при определении степени загрязнения пищевых продуктов посторонней, в т.ч. условно патогенной (кишечная группа) микрофлорой, для выяснения диапазона действия антибиотиков и др. целей. Следует учитывать, что некоторые виды бактерий будучи грам + в молодом возрасте, в старых культурах не все интенсивно красятся по Граму. Поэтому для окраски следует брать односуточные или двухсуточные культуры и, кроме того, пользоваться для сравнения контрольными культурами (стандартами), отношение которых к окраске по Граму заранее известно.