Микробиология: Лабораторный практикум, страница 7

На лабораторных занятиях студенты получают пробирки или чашки Петри с культурами бактерий, выращенных на соответствующих питательных средах. При приготовлении препарата необходимо соблюдать определенные правила. Материал из пробирки или чашки с поверхности агаровой среды берут бактериологической петлей, предварительно обожженной в пламени горелки. В ходе дальнейшей работы петлю прокаливают до красного каления перед каждым очередным пассажем и после него (взятие из пробирки капли воды, нанесение ее на стекло, снятие культуры с питальной среды, распределение по поверхности стекла и т.д.). После прокаливания петлю охлаждают на воздухе (держат 2-3 с. ни к чему не прикасаясь), после чего приступают к выполнению очередного этапа.

Приготовление препарата состоит из следующих операций:

1.Приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло из жидкой среды наносят прокаленной и охлажденной петле каплю исследуемой культуры бактерий и равномерно распределяют ее на поверхности стекла тонким слоем. С твердой питательной среды культуру бактерий петлей вносят в каплю водопроводной воды и тщательно размазывают кругообразными движениями. Получается мазок.

2.Высушивание. Мазок подсушивают на воздухе в течение 1-2 мин.

3.Фиксация. Высушенный мазок фиксируют в пламени горелки. Фиксация имеет целью: убить клетки микробов, обеспечить их лучшее прилипание к стеклу и тем самым предохранить препарат от смывания, сделать мазок более восприимчивым к окраске, т.к. мертвые клетки лучше окрашиваются, чем живые.

Простейшим способом является фиксация пламенем. С этой целью предметное стекло с препаратом захватывают большим и указательным пальцами и проводят 3-4 раза через верхнюю часть пламени горелки.

Достаточность нагревания определяют путем прикладывания предметного стекла к руке. Если при этом ощущается легкое жжение, то препарат можно считать фиксированным.

4.Окрашивание. Фиксированный препарат через полоску фильтровальной бумаги обливается раствором краски (например, фуксина) с выдержкой 1,5-2 мин.

5.Промывание. Через 1,5-2 мин. Полоску снимают и препарат с боковой стороны стекла промывают легкой струей водопроводной воды. При этом смывается излишек краски, но сохраняется краситель адсорбированный клетками бактерий. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, окрашенными оказываются только клетки бактерий.

6.Высушивание. Препарат обсушивают досуха с  площадью полосок фильтровальной бумаги.

7.Микроскопирование. На сухой мазок наносят каплю иммерсионного масла изучают препарат с помощью объектива 90х.

Прижизненное наблюдение

Некоторые палочковидные бактерии являются подвижными. Подвижность обусловлена наличием у них жгутиков, тончайших протоплазматических выростов, которые не видны при микроскопировании в оптическом микроскопе. Наличие жгутиков является видовым признаком и всегда учитывается при определении вида бактерий.

Для изучения подвижности обычно берут односуточные или двухсуточные культуры и готовят из них препарат в раздавленной или висячей капле.

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды, в которую петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры бактерий с твердой питательной среды и размешивают до получения однородной суспензии. Если микроорганизмы выращены в жидкой среде, то берут на стекло капли исследуемой жидкости петлей или стерильной пипеткой. Капля накрывается покровным стеклом.

Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под стеклом, не мешают наблюдению. Если их много, то препарат следует переделать. При опускании стекла на каплю прикасаются ребром стекла к краю капли и, постепенно наклоняя, опускают стекло. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не приливалась за края и не попадала на верхняя сторону покровного стекла. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микробные клетки не заслоняли друг друга. Густые препараты разбавляют водой. Приготовленные препараты рассматривают немедленно, т.к. они быстро высыхают. Для микроскопирования на поверхность покровного стекла наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом 90х, в затемненном поле зрения.