Практикум по биохимии. Часть I. Физико-химические методы: Учебное пособие, страница 5

где АН – слабая кислота, А^– – сопряженное основание, m₀ – исходная концентрация слабой кислоты, a – степень ее диссоциации. Поскольку Н₂О и Н₃О⁺ не поглощают свет, оптическая плотность раствора при длине волны l будет равна

D = L(e_AH m_AH + e_A^– m_A^–),                         (15)

где m_AH и m_A^– – концентрации молекул недиссоциированной кислоты и её анионов, e_AH и e_A^– – их мольные коэффициенты экстинкции при данной длине волны.

m_AH + m_A^– = m₀                                               (16)

Положение равновесия реакции (14) зависит от кислотности среды. При добавлении сильных кислот равновесие смещается влево. Наоборот, при снижении кислотности среды можно полностью сместить равновесие вправо. Изучая поглощение раствора в достаточно кислой среде, получаем спектр недиссоциированных молекул кислоты. Измеряя поглощение в достаточно щелочной среде, устанавливаем спектр анионов кислоты.

Из уравнения, аналогичного уравнению (12),

D = Lm₀e_A^– + Lm_AH (e_AH – e_A^–)                     (17)

следует, что зависимость D от рН среды должна иметь вид, показанный на рис. 6. Переходная область (область резкого изменения D) занимает 2-3 единицы рН. При дальнейшем изменении рН (в сторону больших или меньших значений) D изменяется мало и далее принимает постоянные значения: D = D^кисл  и D = D^щел

Рис.6

Отсюда можно найти значения экстинкций обоих форм:

       (18)

Подставляя эти значения в (17), можно найти концентрации m_AH и m_A^– в данном растворе и степень диссоциации кислоты HА:

           (19)

Рис. 6 отвечает случаю, когда e_AН > e_A^–. Если e_AН < e_A^–, то график будет иметь другой вид (рис. 7). Наконец, если измерения ведутся в изобестической точке, D не будет зависеть от рН: на графике получим горизонтальную прямую. Ясно, что в этом случае определить степень диссоциации нельзя.

1.8. Определение константы диссоциации слабой кислоты

Константа диссоциации кислоты АH равна константе равновесия реакции (14)                                          

 ,     (20)

где , , – активности А^–, Н⁺, АН; а , , – коэффициенты активности А^–, Н⁺, АН.

В случае достаточно разбавленных водных растворов = 1, а коэффициенты активности ионов можно определить по формуле Дебая-Гюккеля. При 25°

.                            (21)

Здесь m =  – ионная сила раствора,                        (22)

где m_i – концентрация i-го иона в молях/литр, а z_i – заряд иона в электронных единицах. Для 1,1 – валентного электролита z_i = 1. При расчете ионной силы учитывают все ионы, находящиеся в растворе.

Обычно степень диссоциации определяется не в воде, а в буферном растворе с известным значением рН. Тогда уравнение (20) можно записать в виде

 

(23)

Степень диссоциации  находят по спектрофотометрическим данным. Логарифмируя (23) и учитывая, что рН = – lg a_Н⁺,   имеем

                          (24)

Поскольку pK_a = – lgK_a, приходим к следующему уравнению

                         (25)

С-1. Определение константы ионизации цитидина

спектрофотометрическим методом

Цитидин является одним из нуклеозидов, входящих в состав рибонуклеиновых кислот. Он состоит из гетероциклического основания – цитозина, соединенного N-гликозидной связью с углеводным остатком рибозы. В водных растворах цитидин (В) протонируется с образованием формы ВН⁺, что приводит к диссоциации по схеме:

где  – термодинамическая константа ионизации.

От способности нуклеозидов к ионизации зависят их химические и физические свойства, в частности, реакционная способность. Протонирование оснований влияет также на вторичную структуру нуклеиновых кислот и полинуклеотидов.

В настоящей работе ионизация цитидина изучается спектрофотометрическим методом, позволяющим работать с незначительным количеством изучаемого вещества. Значения a находят путем измерений оптической плотности D в содержащих цитидин буферных растворах с известным значением рН, а также величин оптической плотности кислого и щелочного растворов цитидина:

   (26)

Приборы и реактивы

1. Спектрофотометр.