Практикум по биохимии. Часть I. Физико-химические методы: Учебное пособие, страница 3

1.4. Законы Бугера и Бера. Оптическая плотность

Если раствор в кювете поглощает свет с длиной волны l, то интенсивность выходящего потока  меньше интенсивности падающего света . Величина , называется процентом пропускания.

Поглощение света в бесконечно тонком слое толщиной dx пропорционально падающему на этот слой потоку (закон Бугера) и концентрации m поглощающих свет частиц (закон Бера).  

Следовательно, для слоя  dx имеем

= –m dx,                                     (3)

где  – коэффициент пропорциональности.

Когда переменная толщина слоя x меняется oт 0 до L, где L – толщина раствора в кювете, интенсивность света меняется от  до . Интегрируя (3) в этих пределах

                                    (4)

находим

,                                (5)

где 2,303 – коэффициент перехода от натурального к десятичному логарифму.

Величина , определяемая формулой

 ,                                            (6)

называется оптической плотностью раствора. Чем сильнее поглощает раствор свет, тем больше его оптическая плотность. Из сравнения формул (5) и (6) следует

                        (7)

Коэффициент пропорциональности e_l называется мольным коэффициентом поглощения или молярной экстинкцией. e_l характеризует способность данного вещества взаимодействовать со световым потоком длины l и зависит от свойств молекулы, природы растворителя, температуры и длины волны.

В спектрофотометрии концентрацию m  выражают в молях на литр, толщину слоя L – в cм. Оптическая плотность – безразмерная величина. Следовательно, e_l имеет размерность л×моль^-1×cм^-1. Из (7) видим, что e_l численно равно D_l при m = 1 м/л и L = 1 cм.

Величина e_l при достаточно малых концентрациях вещества m, как правило, не зависит от концентрации, однако, в спектроскопии принято начинать исследование с проверки пропорциональности между  и m, т.е. с проверки выполнения закона Бера. Отклонения от этого закона часто имеют место уже при концентрациях             10^-3 ё 10^-4 м/л. Эти отклонения вызываются ассоциацией растворенных частиц и другими причинами, которые приводят к изменению энергетического состояния поглощающих частиц в растворе.

1.5. Учет поглощения растворителем.

Разностный метод измерений

Проходя кювету с исследуемым раствором, световой поток поглощается всеми частицами раствора, в том числе и молекулами растворителя. Поскольку концентрация растворителя велика, необходимым условием для нахождения концентрации растворенного вещества по спектрам является полная прозрачность растворителя. В качестве таких растворителей используются вода, хорошо очищенные спирты, CCl₄, гексан и др. Однако, даже в этом случае вклад растворителя в поглощение может быть существенным.

Для исключения этого эффекта в спектрофотометрии применяют разностный метод измерений: кювета с исследуемым раствором сравнивается с аналогичной кюветой, заполненной чистым растворителем.

Этот принцип использован в современных спектрофотометрах, в которых интенсивность потока света, выходящего из кюветы с раствором, автоматически относится к интенсивности потока света, выходящего из кюветы сравнения , а величина падающего потока вообще не измеряется. В дальнейшем под оптической плотностью мы будем понимать величину, определяемую уравнением (8):

                                                (8)

Окончательная формулировка закона Бугера-Бера выглядит следующим образом:

D = e_l m L                                          (9)

Этот закон служит основой для анализа сложных смесей по спектрофотометрическим или колориметрическим данным. Если экстинкция растворенного вещества известна из отдельных измерений и закон Бера выполняется, то, определяя значения D_l при различных l, по уравнению (9) можно рассчитать неизвестную концентрацию растворенного вещества m. Однако для сложных смесей результаты таких измерений становятся менее надежными.

1.6. Электронные спектры смеси частиц.

Изобестическая точка.

Выбор характеристической длины волны

Предположим, что в растворе содержится два вида частиц А и В, причем их концентрации связаны соотношением