Бромистый этидий – флуоресцирующий краситель, интеркалирующий между соседними основаниями ДНК. УФ-излучение, поглощаемое ДНК в области 260 нм, передается на краситель и испускается затем в краснооранжевой области видимого спектра (590 нм). В связи с этим краситель используется для визуализации полос ДНК при электрофорезе.
Приборы и реактивы
1. Прибор для электрофореза.
2. Автоматические пипетки.
3. Ультрахемископ для обнаружения окрашенных полос ДНК.
4. агароза фирмы Кох-Лайт (Англия).
5. ДНК фага лямбда (концентрация, примерно, 500 мкг/мл).
6. Маркер лямбда ДНК\HindIII (концентрация, примерно, 500 мкг/мл).
7. Раствор этидий бромида 5 мкг/мл.
8. 0,02% раствор бромфенолого синего и 50 мМ
ЭДТА в 50 %
глицерине.
9. Буфер для электрофореза (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0).
Экспериментальная часть
Приготовление 1 % агарозы. 0,5 г агарозы поместить в коническую колбу, добавить 50 мл буферного раствора и поставить в кипящую водяную баню на 20-30 минут до полного расплавления агарозы, периодически перемешивая. Затем охладить до 65 °С и залить в кювету для электрофореза. (Расстояние между пластинами 7 см).
Для этого сначала с помощью пипетки в I мл залить щели в кювете небольшим количеством расплавленной агарозы. Затем, когда этот расплав затвердеет, вылить в форму остальной горячий (65 °С) раствор агарозы и немедленно вставить на расстоянии примерно 2 см от поперечной пластины гребенку, от зубцов которой в геле останутся "карманы" для проб. Необходимо, чтобы между дном "кармана" и основанием геля оставался слой агарозы толщиной 0,5-1 мм.
После того как гель полностью затвердеет (через 30-45 минут после заливки), осторожно удалить гребенку и поперечные пластины, образующие кювету.
Далее залить в кювету буферный раствор таким образом, чтобы гель сверху был покрыт слоем раствора толщиной 1–5 мм.
Проведение электрофореза (на двоих студентов). Внести в две пластиковые пробирки автоматической микропипеткой по 30 мкл буферного раствора и по 10 мкл раствора бромфенолового синего, содержащего ЭДТА. Добавить в первую пробирку 3 мкл ДНК, во вторую – 4 мкл маркера HindIII, перемешать.
Каждому студенту внести микропипеткой по 10 мкл ДНК в два "кармана" геля и в следующие два “кармана” – по 10 мкл маркера.
Подключить электроды к источнику постоянного тока.
ВНИМАНИЕ! Отрицательно заряженные молекулы ДНК и ее фрагменты движутся к аноду. Включить напряжение.
За протеканием электрофореза следят по движению красителя (бромфенолового синего). Когда краситель пройдет 2/3 длины геля, можно отключить напряжение.
Осторожно вынуть гель вместе со стеклом, перенести в пустую кювету для проявления, осторожно сдвинув его шпателем со стекла (не повредите гель!). Залить раствор бромистого этидия.
ВНИМАНИЕ! Бромистый этидий - сильный мутаген. Работу с ним необходимо проводить в перчатках.
Через 40 минут вынуть гель из раствора бромистого этидия, осторожно подведя под него стекло. Отмыть дистиллированной водой находящийся на стекле гель. Сняв со стекла, поместить его под ультрахемископ для обнаружения полос ДНК и ее фрагментов.
Показать преподавателю картину флюоресценции в геле и зарисовать ее на бумаге. На основании данных о длине ДНК и сайтах рестрикции рассчитать длину фрагментов ДНК для маркера и нарисовать предполагаемую электрофореграмму. Сравнить ее с полученным результатом.
Рекомендуемая литература
1. Д. Г. Кнорре, Л. Ф. Крылова, В. С. Музыкантов. Физическая химия. М.: Высш. шк., 1990.
2. Д. Г. Кнорре, С. Д. Мызина. Биологическая химия. М.:Высш. шк., 1998.
3. Б. В. Айвазов. Введение в хроматографию. М.: Высш. шк., 1983.
4. Методы исследования нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1970
5. Т.Маниатис и др. Молекулярное клонирование. М., "Мир", 1984.
6. Л.А.Остерман. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М., "Наука", 1981.
 |
|||
 |
|||
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.