Практикум по биохимии. Часть I. Физико-химические методы: Учебное пособие, страница 26

Для определения объема фракции – величины, необходимой для расчетов, в мерный цилиндр количественно перенести содержимое 10-15 фракций, замерить объем и рассчитать объем одной фракции, V_фр..

Измеряют линейкой величины диаметра колонки и высоты столба геля в колонке, откуда рассчитывают объем V_t.. Измеряют также длину и внутренний диаметр шланга, идущего от колонки к коллектору, и рассчитывают его объем.

Строят профиль элюции, откладывая на оси абсцисс номер фракции, а на оси ординат – оптическую плотность. Определяют по графику номера фракций N_фр., соответствующих максимальному значению оптической плотности для каждого из трех пиков.

В соответствии с рис.5, рассчитывают V_e для каждого вещества как N_фр.·V_фр.. Точное значение V_e получается после вычета поправки , где v₁ – объем нанесенной пробы; v₂ – объем шланга, идущего от колонки к коллектору.

Далее заполняют таблицу:

По формуле (15) рассчитывают величины K_av  для цитохрома С и хромата калия.

Данные свести в таблицу:

Оценить ширину пиков w для цитохрома С и хромата калия, как показано на рис.5. Затем по формулам (10) и (11) рассчитать число эффективных теоретических тарелок n и величину ВЭТТ.

Данные свести в таблицу:

5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Электрофорез – движение заряженных частиц в растворе под действием электрического поля. При движении заряженной сферической частицы в однородном электрическом поле в отсутствии солей ее электрофоретическая подвижность

U = V/E,

где V – скорость частицы, а Е – напряженность электрического поля.

Электрофоретичеcкая подвижность частицы определяется условием равенства силы, действующей на частицу со стороны поля, и силы трения, обусловленной вязкостью среды:

QE = 6πrηV,

где Q – заряд частицы, r – ее радиус, η – вязкость среды.

Таким образом, для свободного электрофореза непроводящей сферической частицы в диэлектрике

U = V/е = Q/6πrη.

Следовательно, подвижность частицы прямо пропорциональна ее заряду и обратно пропорциональна ее размеру.

В реальных условиях на подвижность заряженной частицы влияют ионная сила раствора (за счет экранировки заряда частицы солями буфера), рН (меняет степень диссоциации, значит и эффективный заряд) и другие факторы.

При электрофорезе в геле подвижность оказывается меньше, чем в случае свободного электрофореза

U/U₀ = α,

где U_о – подвижность при свободном электрофорезе, α – коэффициент задержки (α <1).

Коэффициент задержки α является параметром, зависящим от размера пор и природы геля и от размеров и формы разделяемых молекул.

Таким образом, эффект молекулярного сита, лежащий в основе гель-электрофореза, состоит в том, что отдельные молекулы разделяются не только по их общему электрическому заряду, но также и по величине (молекулярный вес) и по форме (пространственная структура).

Э-1. Гель-электрофорез ДНК

Поведение нуклеиновых кислот при гель-электорофорезе имеет некоторые особенности по сравнению с поведением других молекул. Главное отличие нуклеиновых кислот от других биополимеров – отрицательный и значительный суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты. Величина этого заряда слабо зависит от рН в достаточно широком диапазоне рН, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот, поэтому фракционирование их при электрофорезе в геле идет за счет различия размеров и формы молекул, а не их зарядов.