Практикум по биохимии. Часть I. Физико-химические методы: Учебное пособие, страница 17

Построить графики зависимости D⁴⁰⁰ от t. По начальным линейным участкам кинетических кривых вычислить скорости реакций в DD⁴⁰⁰ / Dt 1/мин., как это показано на рисунке:

Результаты свести в таблицу:

Далее рассчитать скорости реакций в моль/л×мин, воспользовавшись формулой:

;

где л/моль·см – молярный коэффициент экстинкции n-нитрофенола при 400 нм (см. формулу (9) раздела 1.6.); 10 – коэффициент, учитывающий разбавление реакционной смеси 0,02 М раствором NaОН при остановке реакции.

Рассчитанные скорости гидролиза п-нирофенилфосфата, а также обратные им величины свести в таблицу:

По данным таблицы построить график в координатах:  – . Из графика найти значения V_max и K_m, как это показано на рис.2.

4. ХРОМАТОГРАФИЯ

4.1. Область приложений

Хроматография – группа современных высокоэффективных методов разделения, основанных на распределении вещества между двумя фазами в сочетании с его перемещением в одной из фаз.

Термин «хроматография» («цветозапись») принадлежит М. С. Цвету, который при анализе растительных пигментов на колонке с углекислым кальцием наблюдал разделение зон различной окраски (1903, 1907 гг.). За открытие жидкостной распределительной хроматографии на колонках (1941 г.), которое впоследствии привело к развитию бумажной хроматографии, Мартин и Синдж были удостоены Нобелевской премии. Мартину и сотр. принадлежит также честь открытия газожидкостной хроматографии (1941, 1952 гг).

Хроматографические методы широко используются в лаборатории и промышленности для качественного и количественного анализа смесей, идентификации веществ, препаративного разделения и очистки. Следует подчеркнуть особую роль этих методов в биохимических исследованиях для анализа и выделения в чистом виде белков, аминокислот, компонентов нуклеиновых кислот, антибиотиков, витаминов и т.д.

Аналитические возможности хроматографии нашли широкое применение в физической химии при изучении равновесий, кинетики и механизма химических реакций, растворимости веществ.

4.2. Коэффициент распределения

Методы равновесной хроматографии основаны на разном распределении разделяемых веществ между фазами.

Рассмотрим систему двух фаз 1 и 2, которые свободно обмениваются частицами и имеют объемы V₁ и V₂. Среднее число частиц одного сорта в этих подсистемах – N₁ и N₂. Предполагается, что эти числа достаточно велики, и система находится в термодинамическом равновесии.

Вероятность нахождения частицы в фазе 1 можно определить как отношение числа частиц в этой фазе к общему числу молекул в системе:

                                         (1)

Примем во внимание, что после некоторого числа столкновений с другими молекулами в течение времени t₁, которое можно назвать cредним временем жизни в состоянии 1, частица переходит в среду 2, затем вновь возвращается в среду 1 и т. д. Обозначим среднее время пребывания частицы в среде 2 как t₂.

Поскольку выбранная частица ничем не отличается от других, поведение всех частиц должно быть в среднем таким же. Тогда вероятность нахождения частицы в фазе 1 можно выразить через средние времена «жизни» частицы в двух средах как

W₁ = t₁/(t₁ + t₂),                                   (2)

Сравнивая (1) и (2), находим

,                                                           (3)

Концентрация вещества в фазе 1 равна m₁, а в фазе 2 – m₂:

где N – число Авогадро.

Коэффициент распределения частиц a между двумя фазами определяется соотношением сродства вещества к каждой из фаз и равен отношению концентраций вещества в них. Из формулы (3) следует, что

.                                  (4)

Отсюда следует, что концентрация частиц в некоторой фазе 1 (при заданном объеме) тем больше, чем больше среднее время «жизни» в ней частицы t₁ или, что-то же самое, чем меньше подвижность частицы.

4.3. Основное уравнение равновесной хроматографии