Значительное отставание С и А от других нуклеозидов объясняется наличием у них полярных аминогрупп, обладающих высокой адсорбционной способностью (см. (14)).
Отставание С от А происходит из-за большей основности цитидина, что обеспечивает большую степень его протонирования по сравнению с А, а это, в свою очередь, повышает полярность цитидина.
Большая скорость движения Т по сравнению с U объясняется, по-видимому, отсутствием у тимидина полярной 2'-окси-группы, а также наличием гидрофобной 5-метильной группы.
Экспериментальная часть
Размечают пластинку в соответствии с приведенным ниже рисунком (расстояния даны в мм). Места нанесения веществ на линии старта отмечают и подписывают карандашом. (Линию фронта не отмечают).
При помощи капилляров наносят тремя касаниями 1%-ные растворы веществ. Диаметр пятен » 2 мм. В камеру наливают систему растворителей, смачивая при этом бумажную обкладку стенок, осторожно помещают туда пластинку и плотно закрывают камеру. Глубина погружения пластинки в растворитель » 5 мм, а уровень жидкости не касается линии старта.
После окончания хроматографии (пробег растворителя » 100-120 мм) вынимают пластинку; отмечают карандашом линию фронта
растворителя и затем обнаруживают пятна веществ по поглощению в УФ-свете,
обводят их карандашом и рассчитывают Rf каждого пятна по формуле (13). Для отчета представляют
хроматограмму и указывают, какие нуклеозиды присутствовали в исследуемой смеси,
их Rf и Rf свидетелей.
Х-4. Разделение смеси декстрана голубого, цитохрома С и хромата калия гель-хроматографией
1. Коллектор фракций.
2. Фотоэлектроколориметр (ФЭК).
3. Колонка с Сефадексом G-75 (или Молселектом Г-75).
4. Пипетка на 1 мл.
5. Пробирки.
6. Элюент (водный раствор NaСl, 9 г/л).
7. Водные растворы: а) голубого декстрана 2000 (18 мг/мл),
б) цитохрома С (30 мг/мл),
в) хромата калия (10 мг/мл),
содержащие NaСl (18 г/л).
Сефадекс (как и молселект), представляет собой гранулированный декстрановый гель, причем номер 75 характеризует пористость геля (75 мл воды связывается 10 г сухого геля). Декстраном называется высокомолекулярный полисахарид, построенный из остатков глюкозы, содержащий α-(1→6)-, а в точках разветвления – α-(1→3)- гликозидные связи. Используемая в работе разделяемая смесь содержит голубой декстран, сравнимый по размеру молекул с сефадексом. Это приводит к тому, что декстран не способен проникать внутрь гранул геля.
Экспериментальная часть
Перед выполнением практической части работы необходимо ознакомиться с работой коллектора фракций и ФЭК. Для выбранного типа геля (Сефадекс или Молселект G-75) и размеров колонки (25х600 мм) оптимальная скорость элюции около двух миллилитров в минуту. Фракции рекомендуется отбирать по 5 мл, установив время отбора одной фракции на коллекторе при данной скорости элюции. Заполнить ячейки коллектора пробирками. Проверить вертикальность крепления колонки.
Удалить элюэнт над поверхностью геля и перекрыть колонку. Пипеткой с микровинтом осторожно нанести на гель 1 мл смеси растворов декстрана, цитохрома С и хромата калия. Очень важно при этом не нарушить ровную поверхность геля. Дают смеси впитаться (при этих процедурах гель не должен пересохнуть). После этого осторожно вводят в колонку слой элюэнта, закрывают сверху пробкой со шлангом, идущим от поставленной выше банки с элюентом, открывают колонку и включают коллектор.
Оптическую плотность во фракциях определяют на ФЭКе в кювете толщиной 5 мм. Выход с колонки декстрана голубого регистрируют на длине волны 670 нм, после чего устанавливают длину волны 400 нм, необходимую для регистрации выхода цитохрома С и хромата калия. Результаты записывают в виде таблицы «Nфр. – D» После измерения оптической плотности раствор из кюветы количественно возвращают в соответствующую пробирку. Хромат калия элюируется последним. После этого коллектор выключают.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.