Выбор геля и его пористости зависит от конкретной задачи. Для разделения коротких фрагментов нуклеиновых кислот – олигонуклеотидов, содержащих единицы и десятки мономерных звеньев, электрофорез ведут в полиакриламидном геле (ПААГ) с концентрацией от 5 до 20 %, в зависимости от задачи.
Для разделения плазмид, крупных рестриктов ДНК и целых молекул ДНК и РНК вирусов электрофорез ведут в агарозном геле, т. к. использование ПААГ для этих целей затруднено из-за его меньшей прочности при необходимой пористости.
Подвижность ДНК при электрофорезе в агарозном геле определяется пятью главными параметрами:
I) Размер молекул ДНК.
Молекулы линейной двухцепочечной ДНК перемещаются в геле предположительно одним концом вперед со скоростями, обратно пропорциональными логарифму их молекулярных масс.
2) Концентрация агарозы.
ДНК данного размера перемещаются в геле, содержащем разные концентрации агарозы, с разными скоростями. Между логарифмом электрофоретической подвижности ДНК U и концентрацией геля t существует прямая зависимость:
lgU = lgU0 - Кτ τ.
где Кτ – коэффициент замедления, зависящий от свойств геля, а также от величины и формы движущихся молекул.
3) Конформация ДНК.
ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформации, например, кольцевая неповрежденная (форма I), кольцевая с одноцепочечным разрывом (форма II) и линейная (форма III), движутся в агарозном геле с разными скоростями. Нативное состояние формы I – сверхскрученное кольцо, свернутое в жгут. Это увеличивает компактность и, следовательно, подвижность при электрофорезе. При наличии единичного разрыва (форма II), жгут разворачивается, и силами электростатического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется, компактность молекулы уменьшается, и, значит, увеличиваются размеры и снижается электрофоретичеcкая подвижность. Относительная подвижность линейной двунитевой ДНК (форма III) зависит от среднего размера пор геля. В 0,6 % геле агарозы скорости движения убывают в порядке I > II > III, а в 1,4% геле порядок движения меняется: III > I > II.
4) Напряженность электрического поля Е.
При низких напряженностях скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. С увеличением Е уменьшается область эффективного разделения ДНК за счет непропорционального увеличения подвижности высокомолекулярных ДНК. Для оптимального разделения используется Е не более 5 В/см (обычно 0,5–2 В/см).
5) Нуклеотидный состав и температура.
Электрофоретическое поведение ДНК в агарозных гелях (в отличие от ПААГ) слабо зависит от соcтава оснований ДНК или от температуры геля в интервале 4–30 °С. Электрофорез проводится при комнатной температуре.
Бактериофаг l– вирус, содержащий двухцепочечную ДНК.
ДНК фага l имеет размер около 50 kb, т.е. 50 тысяч пар оснований. В зрелых вирусных частицах это линейная двухцепочечная ДНК с одноцепочечными комплементарными (липкими) концами длиной по 12 нуклеотидов.
Проникая в бактерию-хозяина, липкие концы слипаются и ДНК замыкается в кольцо и транскрибируется как кольцевая молекула. Кольцевая молекула состоит из 48502 пар оснований. При лизогенном развитии ДНК фага l встраивается в ДНК бактерии-хозяина и далее реплицируется и передается клеткам-потомкам как обычный хромосомный ген. На этом основано широкое использование ДНК фага l в генной инженерии в качестве векторной молекулы.
Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) – это ферменты, узнающие определенные последовательности (сайты рестрикции) в двухцепочечной ДНК и расщепляющие молекулу ДНК в этих сайтах. Рестриктаза HindIII узнает последовательность
5’-----A¯AGCT T----
3’-----T TCGAA----
и расщепляет ДНК с образованием липких концов.
На ДНК фага l обнаружено 7 сайтов для рестрикции HindIII (23130, 25157, 27479, 36895, 37459, 37584 и 44141 н. п.).
Цель предлагаемой работы – провести электрофорез ДНК фага λ и маркера молекулярных весов ДНКλ\HindIII в агарозном геле и сравнить результат с предполагаемой картиной флюоресценции в геле.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.