Практикум по биохимии. Часть I. Физико-химические методы: Учебное пособие, страница 15

5.  Раствор 30%  сахарозы (готовить раз в неделю)

6.  Мерные цилиндры на 25 мл

7.  Колбочки на 100 мл

Структурная формула молекулы сахарозы:

a-D-глюкопиранозил–(1®2 )–b–D–фруктофуранозид

Сахароза состоит из глюкозы и фруктозы, соединенных между собой гликозидной связью, которая в водных растворах при нейтральных рН устойчива. При добавлении к раствору сахарозы сильной кислоты гликозидная связь гидролизуется:

Целью данной задачи является определение кинетических параметров реакции гидролиза сахарозы в присутствии катализатора – сильной кислоты. В качестве метода исследования выбрана поляриметрия, так как все три (исходное и конечные продукты реакции) вещества имеют в своем составе асимметрические атомы углерода и являются оптически активными (способны вращать плоскость поляризации света).

По мере течения реакции правое вращение водного раствора сахарозы будет сменяться левым, поскольку суммарное вращение эквимолярной смеси глюкозы и фруктозы имеет знак «–» и соответствует левому вращению. Получение экспериментальной зависимости уменьшение угла вращения плоскости поляризации от времени реакции (пропорциональное уменьшению концентрации сахарозы в растворе) достаточно для расчета всех кинетических параметров данной реакции.

Устройство поляриметра позволяет вести реакцию гидролиза сахарозы непосредственно в поляриметрической трубке (см. описание).

Экспериментальная часть

Перед выполнением практической части задачи необходимо ознакомиться с принципом измерений на поляриметре и его устройством. Определяют нулевое положение шкалы анализатора на приборе. Для этого заполняют трубку дистиллированной водой и измеряют угол α. (Торцевые стекла перед измерением протирают насухо салфеткой). Освоение техники измерений на поляриметре проверяет преподаватель.

После этого приступают к выполнению задачи. Включают термостат на 30°С. В две колбочки заливают с помощью мерных цилиндров по 15 мл 30% раствора сахарозы и 0,6 М НС1, закрепляют их в термостате и дают растворам прогреться до установленной температуры (около 15 минут).

В это время заливают в трубку исходный раствор сахарозы и определяют его угол вращения α. Трубку после измерений ополаскивают дистиллированной водой, закрывают и помещают в термостат.

После прогрева содержимое двух колб (30% раствор сахарозы и 0,6 М HCl) смешивают, переливая растворы из одной колбочки в другую, одновременно включив секундомер, отсчитывающий время реакции.

Вынимают из термостата трубку, откручивают одну зажимную обойму, заполняют ее реакционной смесью, затем измеряют угол вращения α_t, фиксируя синхронно время, при котором на поляриметре было достигнуто равномерное затемнение полей.

После этого трубку возвращают в термостат до следующего измерения. Рекомендуется определять угол вращения по возможности оперативно, чтобы избежать охлаждения реакционной смеси в трубке. Следующее измерение делают через 8-10 мин и т.д. (всего 10-12 измерений при 30°С).

Аналогично проводят реакцию при 40°С и 50°С. Для каждой из температур готовят свежие реакционные смеси.

Следует иметь в виду, что с повышением температуры скорость реакции и соответственно изменение угла вращения будут возрастать, т. е. промежутки времени между измерениями с увеличением температуры реакции следует уменьшить (6-8 мин при 40°С и 3-4 мин при 50°С). Результаты записывают в таблицу:

Определяют a_¥ – угол вращения реакционной смеси при полном гидролизе сахарозы. Для этого либо оставляют реакционную  смесь при комнатной температуре на несколько дней, либо прогревают ее на кипящей водяной бане около 30 мин, после чего измеряют a_¥. Величина a_¥ практически не зависит от температуры.

Расчеты

Используемые в расчетах углы вращения взять с учетом инструментальной поправки, т. е. вычесть нулевое положение шкалы анализатора.

1. Определение концентрации исходного раствора сахарозы.