Практикум по биохимии. Часть I. Физико-химические методы: Учебное пособие, страница 19

Прямая и обращенная хроматограмма. Если проследить за разделением и движением зон компонентов смеси, можно увидеть картину, показанную на рис. 4а.

Наиболее быстро (со скоростью U_o) движется компонент с a = ¥, находящийся только в «подвижной» фазе. За время t эта зона пройдет наибольший путь x_o. Далее располагаются зоны других компонентов: точки х₁, x₂, x₃ и т.д. Если провести количественное детектирование концентраций по длине x спустя время t от начала процесса, получаем прямую хроматограмму (рис. 4б).

При хроматографии на колонке удобно следить за процессом по времени выхода компонентов из колонки (время элюции), что ведет к обращенной хроматограмме (рис. 4в). Первым выходит компонент, движущийся с максимальной скоростью U_o, последним – наиболее «медленный» из имеющихся в смеси компонент 3.

Рис. 4

t_i – время выхода вещества, h – высота пика, d – полуширина пика (полная ширина на половине высоты).

Хроматография дает информацию о числе, концентрации и природе компонентов. Если зоны хорошо разделены, каждый пик отвечает отдельному компоненту, и число их равно числу компонентов смеси. Площадь пика (при пропорциональном детектировании) определяет концентрацию компонента в смеси, наконец, его положение дает информацию о коэффициенте распределения a, что можно использовать для идентификации вещества.

По мере продвижения зон расстояние между ними растет, но одновременно происходит расширение зон, пики становятся менее острыми. Уширение связано с эффектами диффузии, неодинаковостью скоростей по всему сечению вследствие гетерогенности системы, стеночными эффектами, неравновесностью процесса и т. д. На практике стремятся к получению предельно узких пиков, что увеличивает эффективность разделения.

4.5. Виды и приемы хроматографии

Арсенал хроматографических методов, используемых в настоящее время, исключительно широк. Рассмотрим принципы классификации, а также наиболее распространенные виды и приемы хроматографии.

Если исходить из природы неподвижной фазы, принято различать адсорбционную, распределительную, ионообменную, аффинную, а также гель-хроматографию.

При адсорбционной хроматографии роль неподвижной фазы выполняет поверхность твердого сорбента, причем взаимодействие разделяемых веществ с поверхностью осуществляется за счет сил физической адсорбции (включая капиллярную конденсацию в порах твердого тела).

При распределительной хроматографии роль неподвижной фазы выполняет растворитель, нанесенный на твердую насадку; взаимодействие с разделяемыми веществами осуществляется за счет сил объемной сольватации. Этот случай напоминает распределение вещества между двумя несмешивающимися жидкостями.

Ионнообменная хроматография основана на кулоновском взаимодействии ионизированных разделяемых веществ с неподвижной фазой – сорбентом, имеющим на поверхности заряженные группы.

Аффинная хроматография. Неподвижная фаза представляет собой твердый носитель, к которому химически присоединены функциональные группы, избирательно связывающие какой-либо из компонентов разделяемой смеси.

В гель-хроматографии используется способность гелей с контролируемыми размерами пор сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размером и формой их молекул. Разделение достигается за счет того, что в поры геля способны проникать молекулы с размером ниже некоторой величины и не могут проникать молекулы большего размера.

Исходя из природы подвижной фазы, принято различать газовую и жидкостную хроматографии. В первом случае подвижная фаза представляет собой газ, во втором – жидкость (элюэнт).

В зависимости от типа прибора различают хроматографию на колонках, капиллярах, пластинках, бумаге.

4.6. Хроматография на колонках

В настоящее время такой тип хроматографии наиболее распространен. Колонка представляет собой стеклянную, пластиковую или металлическую трубку, заполненную неподвижной фазой. Разделяемую смесь вводят в верхнюю часть колонки, затем из резервуара с элюэнтом пропускают через колонку подвижную фазу. Компоненты смеси выходят из колонки (элюируются) в виде раствора в подвижной фазе.