Практикум по биохимии. Часть I. Физико-химические методы: Учебное пособие, страница 21

3) Ионообменная хроматография.

Тонкий слой – ионообменные смолы: DEАE-целлюлоза, DEАE-сефадексы, дауэксы и др. Механизм распределения: ионный обмен между растворенным веществом и заряженными группами неподвижной фазы.

В каждом конкретном случае могут иметь место различные сочетания этих вариантов. Например, адсорбционная хроматография на силикагеле может сопровождаться или распределительной (силикагель всегда содержит адсорбированную воду, которая, если ее много, может служить неподвижной фазой), или ионообменной хроматографией (силикагель – высушенный гель слабодиссоциированной кремневой кислоты, при хроматографии оснований проявляет свойства катионообменника). С другой стороны, распределительная и ионообменная хроматография сопровождаются адсорбцией на поверхности неподвижной твердой фазы.

Из рассмотренных вариантов ТСХ чаще применяют адсорбционную хроматографию, которая лучше освоена, проста по выполнению и, кроме того, для этого метода налажено промышленное производство пластинок с закрепленным слоем силикагеля.

Способность веществ к адсорбции зависит от нескольких факторов:

1)Введение в насыщенные углеводороды двойных связей и, особенно, полярных функциональных групп увеличивает способность этих веществ адсорбироваться. Адсорбционная способность функциональных групп и их полярность увеличиваются в следующем ряду:

СН=СН < ОСН3 < COOR < C=О < CHO < SH < NH2 < OH < СООН  (14)

2)Лучше всего протекает адсорбция из неполярных растворителей.

3) Чем меньше у молекулы стерических затруднений, тем лучше она адсорбируется.

Элюирующая способность растворителей увеличивается с ростом их полярности, например, в рядах:

1) гексан < гептан < ССl4 < хлороформ или

2) эфир < этилацетат < ацетон < изопропанол < этанол < метанол < вода.

4.9. Ионообменная хроматография

При этом виде хроматографии неподвижная фаза представляет собой твердый носитель, содержащий ионные группы (ионит). Если это отрицательно заряженные группы, то он связывает катионы и называется катионитом (катионообменная хроматография). Сорбент, несущий положительно заряженные группы – анионит. Хроматографию на анионитах называют анионообменной. В исходном состоянии заряды неподвижной фазы скомпенсированы какими-либо противоионами. При нанесении на ионит смеси разделяемых веществ происходит обмен этих противоионов на одноименно заряженные компоненты разделяемой смеси.

Прочность связывания с носителем пропорциональна заряду вещества, которое можно смыть (элюировать) растворителем или солью, например, NaCl. Чем меньше заряд вещества, тем меньшая концентрация соли понадобится для его элюирования.

Число «мест» на ионите ограничено его емкостью – количеством заряженных групп. Емкость определяется как количество миллиграмм-молей вещества, которое связывается 1 г ионообменника.

4.10. Гель-хроматография

Гель-хроматография является одним из методов разделения соединений по молекулярному весу и форме молекул. Метод широко применяется в различных областях химии, биохимии, физхимии биополимеров.

Рассмотрим распределение смеси веществ между двумя фазами, одна из которых представляет собой гранулированный гель в растворителе, который является второй фазой.

Пусть гранулы геля имеют поры, размер которых больше размера молекул одного из компонентов разделяемой смеси. Такой компонент может свободно диффундировать в поры геля, тогда как более крупное вещество из-за стерических препятствий хуже проникает в гранулы геля.

Если таким гелем заполнить хроматографическую колонку и пропустить через нее смесь разделяемых веществ, то компоненты этой смеси будут двигаться по колонке с разной скоростью: крупные быстрее (верхний предел – скорость подвижной фазы), а меньшие – более медленно, поскольку их продвижение по колонке будет тормозиться диффузией в неподвижную фазу. В конечном итоге компоненты смеси будут выходить из колонки в порядке уменьшения их молекулярного веса.