pol) - сомнительный результат.
Такой пациент нуждается в динамическом наблюдении и повторном обследовании.
3.Отсутствие Ат к белкам ВИЧ, рассматривается как отрицательный результат.
Метод молекулярных или генных зондов (ДНК-зондов)
в сочетании с цепной полимеразной реакцией.
Принцип метода основан на реакции гибридизации между фрагментом нуклеотидной последовательности (зондом),несущим наиболее специфический для данного вида бактерий ген, с полимерной ДНК изучаемого микроорганизма. С помощью этого метода можно идентифицировать любой биологический объект. Точность метода зависит от качества используемого зонда (его "чистоты"). Наилучшими ДНК-зондами являются полученные путем химического синтеза олигонуклеотидные последовательности, расположение нуклеотидов в которых соответствует идентичному участку гена, или всему гену, ответственному за определенную функцию бактерий. ДНК-зонды метят различными способами, например, изотопными метками, флуорохромами. Однако из-за сложности использования таких зондов они широкого применения не получили.
В настоящее время создают ДНК-зонды, меченые биотином. Для выявления комплекса ДНК-биотин используют белок с высокой связывающей активностью - авидин. Образующиеся при гибридизации с такими зондами дуплексы ДНК выявляют с помощью предварительно меченного ферментом (пероксидазой или щелочной фосфатазой) биотина. В присутствии соответствующих субстратов эти ферменты дают характерную окраску. Разрешающая способность метода может быть значительно повышена с помощью цепной ДНК-полимеразной реакции. В основе цепной полимеразной реакции (ЦПР) лежит многократное реплицирование специфического участка нуклеотидной последовательности, катализируемое ДНК-зависимой ДНК-полимеразой. Для этой цели обычно используют термостабильную ДНК-полимеразу, получаемую из термофильных бактерий. Чувствительность метода исключительно велика, так как он позволяет за несколько часов увеличить число копий исследуемой цепи
ДНК в 106-108 раз. В принципе ЦПР может быть использована для обнаружения любого инфекционного агента, если известна нуклеотидная последовательность гена (или его фрагмента), специфичного исключительно для данного агента. Особенно показано использование ЦПР в тех случаях, когда:
1)трудно выделить чистую культуру возбудителя из-за сложности метода культивирования;
2)возбудитель характеризуется высокой антигенной изменчивостью (в этом случае необходимо с помощью ЦПР обнаруживать наиболее консервативные гены возбудителя);
3)в исследуемом образце имеются крайне низкие концентрации возбудителя (в начальном периоде ВИЧ-инфекции).
ЦПР незаменима для обнаружения во внешней среде так называемых некультивируемых, но жизнеспособных форм бактерий. Соответствующие тест-системы для использования ЦПР с целью обнаружения различных возбудителей разработаны и внедрены в практику.
Метод молекулярной гибридизации (ДНК-зондов) при ВИЧ-инфекции.
Принцип метода: Позволяет выявить не антитела к белкам ВИЧ, способные к перекрестному реагированию, а генетический материал вируса. Из лизата лимфоцитов, инфицированных ВИЧ, получают фракцию, содержащую РНК (в том числе РНК вируса). Затем при участии фермента термостабильной ДНК-полимеразы "нарабатывают" многочисленные молекулы ДНК - копии. Полученную одноцепочную ДНК собируют на специальных фильтрах. После этого к иммубилизованным ДНК
добавляют "зонды" - меченные фрагменты одноцепочечной ДНК, которая получена на матрице РНК ВИЧ. Такие фрагменты способны специфически связываться с иммобилизованными на фильтре молекулами ДНК
(гибридизация). Если исследуемый пул нуклеиновых кислот не содержит генетического материала ВИЧ, то меченные "зонды" не задерживаются на фильтре. По тому, какая часть метки остается на фильтре в результате гибридизации, делают вывод о присутствии в исследуемых лимфоцитах вируса СПИД.
ДНК-полимераза
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.