ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ И МЕТОДЫ ИХ ИНДИКАЦИИ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК.
Для заражения используются чувствительные к данному вирусу культуры с хорошо развитым монослоем клеток, находящиеся в пробирках
(флаконах).
Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1- 0,2мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками.
После 30 - 60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят по 1,0 - 1,5мл на пробирку поддерживающей среды и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вирусов.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД (схема)
┌─────────────────────────────────────────────┐
│ Исследуемый материал (фекалии, носоглоточные│
│ смывы, секционный материал и др.) │
└───────────────────┬─────────────────────────┘
┌──────────────────┴────────────────────┐
│ Обработка антибиотиками для подавления│
│ бактериальной и грибковой микрофлоры,│
│ центрифугирование, фильтрация │
└──────────────────┬────────────────────┘
┌────────┴────────┐
│ Заражение серии │
└────────┬────────┘
┌──────────────────┼────────────────────┐
┌───────┴──────────┐ ┌─────┴───────────┐ ┌─────┴─────┐
│ Куриных эмбрионов│ │ Культуры клеток │ │ Животных │
└───────────┬──────┘ └───────┬─────────┘ └────┬──────┘
┌────┴────────────────┴─────────────────┴───┐
│* Индикация вирусов по следующим феноменам │
└────┬────────────────┬─────────────────┬───┘
┌───────────┴───────┐ ┌──────┴─────────────┐ ┌─┴───────────────────┐
│ Отставание в раз- │ │ ЦПД, образование │ │ Заболевание, гибель,│
│ витии, гибель, │ │ бляшек, цветная │ │ гистологические из- │
│ изменение оболо- │ │ проба Солка, РГадс,│ │ менения в тканях, │
│ чек, РГА │ │ РИФ, интерференция │ │ включения │
└─────────────────┬─┘ └──────┬─────────────┘ └─┬───────────────────┘
│ Пассажи │
┌─┴──────────┴─────────────────┴┐
│ Титрование выделенного вируса │
│ (выбор рабочей дозы) │
└────────────┬──────────────────┘
┌────────────────────────┴───────────────────────────┐
│ Идентификация выделенного вируса в реакциях нейтра-│
│ лизации, РТГадс, РСК, подавление бляшкообразования │
│ и др. с диагностическими сыворотками │
└────────────────────────────────────────────────────┘
* Примечание: выделение, титрование и идентификация вируса проводится с использованием одного и того же феномена.
ФЕНОМЕНЫ, ПОЗВОЛЯЮЩИЕ ВЫЯВИТЬ ВИРУС В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК.
1.Цитопатический эффект (действие) - ЦПЭ (ЦПД), которое является следствием вирусоспецифической дегенерации клеток.
ЦПЭ может быть трех основных типов:
а)кругло- или мелкоклеточная дегенерация;
б)образование гигантских многоядерных клеток- симпластообразование;
в)развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток.
Нормальные клетки Цитопатическое действие
HeLa ФЭЧ
┌─────────┐ ┌─────────┐ ┌─────────┐ ┌─────────┐
│ │ │ │ │ │ │ │
│ │ │ │ │ │ │ │
│ │ │ │ │ │ │ │
└─────────┘ └─────────┘ └─────────┘ └─────────┘
2.Цветная проба Солка.
Принцип метода: рост культуры в питательной среде сопровождается накоплением кислых продуктов метаболизма, что визуально проявляется изменением цвета индикатора в кислой среде. При размножении ряда вирусов клетки погибают, накопления продуктов метаболизма и изменения цвета индикатора не происходит.
Вирус присутствует Вирус отсутствует
│ │ │ │ │ │ │ │
до │ │ после │ │ до │ │ после │ │
инкубации │ │ инкубации│ │ инкубации│ │ инкубации│ │
└──┘ └──┘ └──┘ └──┘
3.Феномен гемадсорбции (РГадс).
Принцип метода: контакт клеток с эритроцитами приводит к адсорбции эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток, что можно увидеть при малом увеличении микроскопа (х7).
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.