Микробиология, вирусология, иммунология: Методические указания для самостоятельной работы и к практическим занятиям для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Часть III, страница 7

Реакция агглютинации применяется в двух направлениях: 1) для определения неизвестной культуры микробов, выделенных от больного или из объектов внешней среды, с помощью известной диагностической сыворотки; 2) для обнаружения и определения титра антител в исследуемой сыворотки с помощью диагностикума. 

Реакцию агглютинации ставят в сухой чистой нестерильной посуде, без следов кислот, щелочей, дезинфицирующих средств.

Пробирочная или развернутая реакция агглютинации основана на разведении сыворотки и определении ее титра. Из исходной сыворотки готовят основное разведение, которое может быть различным и зависит от предполагаемого титра сыворотки. Для приготовления основного разве­дения 1:50 берут 0,2 мл цельной сыворотки и смешивают с 9,8 мл физиологического раствора. Из этого разведения готовят методом переката кратные двум рабочие разведения, число рядов которого зависит от предполагаемого диагностического титра. Как правило, диагностическую сыворотку разводят до титра, который указан на этикетке. В приготовленные разведения сыворотки добавляют антиген. Добавлять его можно капельно или объемно. При объемном методе к равному объему разведенной сыворотки добавляют равный объем антигена, при этомразведения сыворотки соответственно увеличиваются в два раза. При постановке развернутой реакции агглютинации необходимо, чтобы во всех пробирках был объем равный 1 мл. Реакция сопровождается двумя контролями: контролем антигена и контролем сыворотки.

Таблица 5. Схема постановки реакции агглютинации

№№ пробирок	1	2	3	4	5	6
Разведения сыворотки Компоненты	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000	контроль антигена	контроль сыворотки
1. Физиологический раствор	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-
2. Сыворотка, развед. 1:500, титр 1:8000	1,0	1,0	1,0	1,0	В дез.р-р 1,0 мл      -                  1,0
3. Антиген	2 кап.	2 кап.	2 кап.	2 кап.	2 кап.	2 кап.

После смешивания антигена с антителом штатив с пробирками энергично встряхивают и помещают в термостат на 2-4 часа, а затем до суток выдерживают при комнатной температуре. Через 2 - 4 часа производят предварительный учет реакции, а через сут­ки окончательный. Сначала учет производят макроскопически, про­сматривая пробирки до встряхивания в проходящем свете (лучше на темном фоне). Учет начинают с контрольных пробирок. При учете об­ращают внимание на выраженность осадка (форму, величину, плот­ность) и степень просветления надосадочной жидкости. Затем про­бирку осторожно встряхивают, постукивая пальцем по донышку, и наблюдают за распределением осадка, величиной зерен осадка и степенью помутнения жидкости. Для более точной оценки результата пробирки просматривают с помощью лупы или в агглютиноскоп.

Оценка и регистрация результатов. При положительной реакции агглютинации образуется рыхлый осадок, который покрывает все дно пробирки в виде раскрытого парашюта или зонтика, обращенного куполом вниз. Осадок легко разбивается и состоит из хлопьев (Н-агглютинация), либо из плотных зерен (О-агглютинация) или из хлопь­ев и зерен (ОН-агглютинация). Жидкость над осадком просветляется в той или иной мере в зависимости от степени агглютинации.

При отрицательной реакции микробы оседают на дно пробирки по центру, образуя на дне небольшой плотный осадок в виде точки или пятна, надосадочная жидкость остается мутной. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимаясь вверх в виде змейки, при этом жидкость приобретает первоначальную мутность.

Степень положительной реакции агглютинации оценивается в плюсах по четырехбальной системе:

++++  - полная агглютинация, очень большой осадок, полное просветление жидкости, при встряхивании осадок разбивается на хлопья или зерна, жидкость остается прозрачной

+++    -  не полная агглютинация, осадок большой, надосадочная
жидкость слегка опалесцирует

++            -   50% агглютинация, осадок значительно меньший, надосадочная  жидкость слегка мутноватая

+        -   слабая агглютинация, осадок очень малый, надосадочная жидкость мутная       

-          -  отрицательная реакция, осадок отсутствует или небольшой
в виде  пятна, при встряхивании легко поднимается в виде змейки, жидкость мутная

            Положительной считается реакция не менее чем на два плюса.

            Контроль сыворотки должен быть прозрачен, без хлопьев и зерен. Контроль антигена должен быть мутным без хлопьев и зерен, если наблюдается спонтанная агглютинация, реакция не учитывается.

            Результат учитывают по схеме:

№№ пробирок	1	2	3	4	5	6
Разведения сыворотки	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000	контроль антигена	контроль сыворотки
Результат

            Вывод: Реакция агглютинации положительна (отрицательна) на два плюса в разведении ………………………

            Реакция агглютинации с сывороткой больного, благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности получила широкое распространение и применение в диагностике многих заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и др. При оценке реакции возникает необходимость отличить специфическую реакцию (на видовые и типовые антигены) от неспецифической (межвидовые антигены). В этом случае дифференциация основывается на использовании монодиагностикумов, скорости нарастания титра антител к специфическим антигенам. Чтобы отличить иммунный ответ на текущее заболевание от перенесенного ранее, изучают скорость нарастания титра антител, который выше при текущей инфекции, а также определяют титры классов иммуноглобулинов. Кроме того, сопоставляют результаты с бактериологическими и клиническими данными.