Иммуноэлектрофорез
Цель Определение Определение
постановки антигена антитела
Реакция преципитации в геле является одним из наиболее чувствительных методов анализа растворимых антигенов. Разные антигены и антитела диффундируют с различной скоростью, обусловленной неодинаковой величиной молекулы и их концентрацией, поэтому методом диффузии можно разделить и проанализировать многокомпонентные антигены, так как образуются пространственно разделенные преципитаты. Порядок расположения линий преципитации по отношению друг к другу позволяет делать выводы о полном или частичном их сходстве. Оценивая отдаленность иммунного комплекса от линии старта, проводят количественное определение антигена, так как линия пробега пропорциональна концентрации антигена.
В практике используют различные методы постановки реакции преципитации в геле.
а) Простая линейная диффузия по Удену (1946).На агар, содержащий, сыворотку, наслаивают раствор антигена. За счет диффузии антигена в агар достигается оптимальная концентрация его, происходит взаимодействие с антителами и образуются линии преципитата.
б) Двойная линейная диффузия по Окли и Фулторпу (1953). В от-
личи от метода Удена в данном случае антиген
и антитело разделены слоем чистого геля
и диффундируют в слой этого геля навстречу
друг другу, взаимодействуют и образуют
линии преципитата. При избытке дозы
антигена линии преципитата расположены ближе к сыворотке и, наоборот, при недостатке антигена линии
расположены ближе к антигену.
в) Простая радиальная диффузия по Манчини (1963). Данный тест используется главным образом для количественного определения иммуноглобулинов и других белков сыворотки. Преимуществом метода является возможность проведения массовых диагностических исследований. Для постановки реакции в агар вносят антитела, разливают в чашку Петри или на стеклянную пластинку. Затем в агаре делают лунки, куда вносят исследуемые антигены, в другие лунки для контроля вносят стандартные антигены. В результате диффузии антигена вокруг лунки появляются кольца преципитата. Миграция антигена в агар продолжается до тех пор, пока не произойдет полное связывание антигена. Диаметр кольца зависит от концентрации антигена и служит количественным показателем реакции. Сравнивают величину кольца исследуемого антигена и стандартного антигена и делают расчет.
г) Двойная радиальная диффузия по Оухтерлони (1948). При этом методе агар разливают в чашки или на пластины. Специальным пробойником в агаре делают лунки (лунки можно делать параллельно друг другу или по окружности). Если лунки сделаны параллельно, то в одни вносят антиген, а в противоположны - антитела. Антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу и образуют между лунками линии преципитата. Если лунки пробивают по окружности, то в центральную лунку заливают антитела, а в окружающие несколько видов антигена и наоборот. Антигены и антитела диффундируют из лунок, встречаются и в зоне эквивалентности произойдет преципитация, образуется столько линий преципитации, сколько соответствующих пар антиген+антитело имеется в исследуемой системе. При идентичных антигенах линии сливаются, при неидентичных – пересекаются.
д) Иммуноэлекрофорез (Грабар, Уильямс, 1953) представляет собой метод, в котором техника электрофореза соединена с иммунодиффузионным анализом. Метод эффективен для исследования препаратов, содержащих смесь антигенов и антител. Опытную смесь готовят и вносят в стартовую лунку, разделяют с помощью электрофореза в агаровом геле. После этого параллельно миграции антигена делают канавку специальным штампом, в которую вносят преципитирующую сыворотку. Антиген и антитело диффундируют навстречу друг другу, через несколько дней появляются линии преципитации разной степени выраженности, соответственно числу комплексов антиген+антитело, что дает представление о составе исходной смеси антигенов. Иммуноэлектрофорез получил применение при исследовании сывороток. Этим методом можно идентифицировать до 30 линий преципитата.
Известны следующие модификации метода иммуноэлектрофореза:
1.Радиоиммуноэлектрофорез. Антигены и антитела метят радио-активной меткой, что позволяет повысить чувствительность в 10-100 раз.
2. Rocket - иммуноэлектрофорез или электроиммунодиффузия. При этом методе сыворотку смешивают с гелем и разливают на пластинки. Антиген вносят в приготовленную лунку и подвергают действию электрического тока. В результате антиген мигрирует в гель, где взаимодействует с антителами, которые неподвижны и остаются на месте. Процесс продолжается до тех пор, пока все молекулы антигена не будут связаны с антителами. Зона преципитации принимает вытянутую заостренную форму в виде ракеты и находится в прямой зависимости от концентрации антигена.
3. Перекрестный иммуноэлектрофорез. Проводят электрофоретическое разделение антигенной смеси в агаровом геле. Затем слой геля, содержащего антиген, вырезают и переносят на специальную пластину, свободную поверхность которой заливают агаровым гелем, содержащим иммунную сыворотку. Затем вновь проводят электрофорез перпендикулярно первому разу.
4. Встречный электрофорез. Метод предложен для обнаружения преципитатов. Иммунопреципитация происходит в слое геля, но в отличие от метода Оухтерлони контакт антигена с антителом происходит под действием постоянного электрического тока. Эту модификацию проводят с компонентами, мигрирующими в противоположных направлениях или в одном, но с различной скоростью. Если антиген и антитело мигрируют в разных направлениях, то возможно их движение навстречу друг другу и накопление в определенном месте. Данную методику используют для выявления антигенов бактерий в биологических жидкостях, альфа-фетопротеина.
Постановка реакции кольцепреципитации
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.