Реакцию можно поставить в
иммунном организме. Для этого
опытной свинке заранее вводят иммунную
сыворотку, а потом строго
внутрибрюшинно вводят живую суточную культуру. Для контроля эту
же культуру вводят неиммунному животному. Через 10, 30, 60 минут
у свинок берут эксудат, готовят окрашенный препарат и препарат «висячая
капля». В эксудате от опытного животного наблюдают этапы бактериолиза вплоть до полного исчезновения микробов (положительная
реакция бактериолиза). В эксудате от контрольного животного количестве клеток наоборот увеличивается.
Реакцию бактериолиза можно поставить в пробирке. Для этого смешивают иммунную сыворотку с живой культурой микроба и комплементом. Смесь помещают и термостат на 1 час, после чего делают посев на чашку Петри с МПА. Чашку выдерживают в термостате 18-25 часов, затем подсчитывают число выросших колоний.
б) Реакция иммунного гемолиза основана на способности эритроцитов, соединенных с соответствующими антигенами растворяться в присутствии комплемента.
В качестве антигена используют эритроциты.
Антитела, участвующие в реакции гемолиза называют гемолизинами, а сыворотки, содержащие такие антитела – гемолитическими. Гемолитическую сыворотку получает путем гипериммунизации животных чужеродными эритроцитами. Обычно для реакции гемолиза принято пользоваться в качестве антигена бараньими эритроцитами, а гемолитическую сыворотку получают путем гипериммунизации кролика бараньими эритроцитами.
Реакция гемолиза состоит в том, что при взаимодействии гемолитической сыворотки в присутствии комплемента происходит гемолиз эритроцитов. При этом мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость, так называемую «лаковую» кровь.
Реакция иммунного гемолиза характеризуется специфичностью, так как она положительна только с теми эритроцитами, которые были взяты для иммунизации при получении гемолитической сыворотки. Этим она отличается от гемолиза эритроцитов, получаемого каким-либо другим путем. Реакция иммунного гемолиза используется для титрования гемолитической сыворотки, определения активности комплемента, как индикаторная в РСК.
Методические указания к демонстрации
Демонстрация опыта титрования комплемента
В качестве комплемента используется свежевзятая или консервированная сыворотка морской свинки, разведенная 1:10. Титр комплемента определяется в реакции иммунного гемолиза.
Берут ряд пробирок, в которые разливают комплемент (1:10) в объеме от 0,05 до 0,5 мл, после чего объем в каждой пробирке доводят до 0,5 мл физиологическим раствором. Пробирки помещают в термостат на 45 мин. Одновременно готовят гемолитическую систему, состоящую из равных объемов гемолитической сыворотки в рабочем титре и 3% взвесь бараньих эритроцитов. Приготовленную систему по 1,0 мл добавляют в пробирки с комплементом. Параллельно ставят контроль гемолитической системы и комплемента. Все пробирки помещают в термостат на 30 мин, после чего определяют титр комплемента. Под титром комплемента понимают то его наименьшее количество, т.е. наибольшее разведение, которое вызывает полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов.
Демонстрация опыта титрования гемолитической сыворотки
Гемолитическую сыворотку готовят путем гипериммунизации кролика эритроцитами барана. При титровании гемолитическую сыворотку разводят от 1:1000 до 1:4500. Приготовленные разведения по 0,5 мл разливают в пробирки, туда же приливают по 0,5 мл 3% взвеси бараньих эритроцитов и 0,5 мл комплемента в рабочей дозе. Объем жидкости в каждой пробирке доводят до 2,5 мл физиологическим раствором. Параллельно ставят контроли гемолитической системы и эритроцитов. Пробирки помещают в термостат на 1 час, после чего учитывают результат и определяют титр гемолитической сыворотки. Под титром гемолитической сыворотки понимают то ее наибольшее разведение, 0,5 мл которого вызывает полный гемолиз 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов в присутствии рабочей дозы комплемента.
Методические указания к практической работе
Реакция связывания комплемента (РСК, реакция Борде-Жангу)
Реакция связывания комплемента основана на способности комплемента полностью или частично адсорбироваться на комплексе антиген+антитело. Адсорбция комплемента на комплексе антиген+антитело визуально не проявляется, т.е. видимого комплекса не образует. Для того, чтобы установить произошла адсорбция комплемента или он остался свободным, в реакцию вводится вторая система – индикаторная, гемолитическая. Она состоит из антигена (эритроцитов барана) и антител (гемолитическая сыворотка). Если комплемента в растворе нет, так как он адсорбировался на комплексе антиген+антитело в первой части реакции, гемолиза во второй части реакции не будет, эритроциты осядут на дно пробирки, реакция положительная. Если же комплемент остался в растворе, так как нет взаимодействия между антигеном и антителами в первой части реакции, то наступает гемолиз эритроцитов, образуется «лаковая кровь», реакция отрицательная.
РСК характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью. Она может быть применена для диагностики почти всех инфекционных заболеваний, как для обнаружения антигена, так и для определения антител. Сложность постановки реакции обусловлена количеством вводимых компонентов, необходимостью определять точные количественные соотношения.
1. Исследуемая или свежее взятая иммунная сыворотка перед опытом подвергается прогреванию при 56°С в течение 30 мин для инактивации, т.е. разрушения собственного комплемента. После инактивации сыворотку разводят 1:5.
2. Антиген готовят или из культур микробов или органов инфицированного или здорового животного. Антиген титруют и определяют то его количество, при котором отсутствует тормозящее на комплемент действие.
3. Комплемент титруют и определяют его рабочую дозу. Рабочая доза комплемента – это количество комплемента, увеличенное против титра на 25-30%. Это необходимо потому, что активность комплемента может быть несколько подавлена другими ингредиентами.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.