4. Гемолитическая сыворотка титруется, для постановки реакции используют сыворотку, усиленную против титра в 3-4 раза. Например, если титр сыворотки 1:1800, то в реакции применяют разведение 1:600.
5. Эритроциты барана получают из стерильно взятой дефибринированой крови, их отмывают, центрифугируя трижды с новыми порциями физиологического раствора, а потом готовят 3% взвесь.
Из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки готовят гемолитическую систему, смешивая равные объемы сыворотки и эритроцитов.
Только после подготовки всех компонентов ставят основной опят РСК. Реакция состоит из двух фаз, каждая из которых представляет самостоятельную иммунологическую реакцию, требующую определенных постоянных условий для своего проявления. Общепринятой является методика проведения реакции в 1 фазе в течение одного часа при 37°С, во второй фазе – в течение 30-60 мин при 37°С. Оттитрованные компоненты разводят физиологическим раствором так, чтобы рабочая доза их содержалась в объеме 0,5 мл.
Реакцию ставят с одним (полуколичественный способ) или несколькими (количественный способ) разведениями сыворотки, добавляя компоненты в следующем порядке: разведенная инактивированная сыворотка, антиген, рабочая доза комплемента, гемолитическая система по схеме:
Таблица 6. Схема постановки РСК.
|
Компоненты реакции |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
Инактивированная сыворотка |
0,5 |
0,5 |
- |
0,5 |
|
Антиген в рабочей дозе |
0,5 |
- |
0,5 |
0,5 |
|
Комплемент в рабочей дозе |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
- |
|
Физиологический раствор |
- |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
В термостат при 37°С на один час |
||||
|
Гемолитическая система |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
|
В термостат при 37°С на один час |
||||
Учет через 24 часа.
Интенсивность реакции оценивают по 4-х бальной системе плюсами:
++++ - полная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, жидкость над ними не окрашена, прозрачная
+++ - неполная задержка гемолиза, осадок эритроцитов значительный, жидкость над эритроцитами слабо-розоватого цвета
++ - частичная задержка гемолиза, жидкость красная, осадок эритроцитов
+ - слабая задержка гемолиза, жидкость интенсивно красная, незначительный осадок эритроцитов
± - следы задержки гемолиза, гемолиз почти полный, при взбалтывании со дна поднимается незначительный осадок в виде облачка
- - полный гемолиз, осадок отсутствует.
Таблица 7. Схема учета РСК
|
№ пробирок |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
Результат |
Вывод: ____________________________________________________________
ЗАНЯТИЕ 27
ТЕМА: РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ТОКСИНА АНТИТОКСИНОМ. РЕАКЦИЯ ФЛОККУЛЯЦИИ
Цель занятия: Изучить сущность реакции нейтрализации токсина антитоксином, реакции флоккуляции, их практическое применение, информативность, оценку
План занятия
1. Реакция нейтрализации токсина антитоксином
2. Реакция флокуляции. Методы постановки. Целевое назначение
3. Реакция нейтрализации биологической активности ферментов. Диагностическое значение
Реакция нейтрализации токсина антитоксином основана на способности антител нейтрализовать действие экзотоксина бактерий.
В качестве антигена используют белковые токсины бактерий (экзотоксины), сила которых выражается в специальных единицах.
Dlm – минимальная летальная доза – наименьшая доза токсина, способная убить животное определенного вида, веса в течение определенного времени. Например: для дифтерийного токсина – наименьшее его количество, которое убивает морскую свинку весом 250 г в течение 4 дней.
Lm – наибольшее количество токсина, которое в смеси с 1 антитоксической единицей антитоксина, введенное морской свинке весом 250 г не дает никакой видимой реакции
Lt – наименьшее количество токсина, которое в смеси с 1 антитоксической единицей антитоксина, введенное морской свинке весом 250 г приводит к ее гибели в течение 4 дней
Lf – доза или единица флокуляции – это количество токсина, которое дает самую быструю реакцию флокуляции при смешивании токсина с одной из доз антитоксической сыворотки
В качестве антитела используется антитоксическая сыворотка, сила которой измеряется в антитоксических или международных единицах. За международную единицу антитоксина принимают то его наименьшее количество, которое нейтрализует стандартную дозу токсина.
Нейтрализация токсина антитоксином получается в строго определенных пропорциях и при одномоментном добавлении всего количества токсина к антитоксину. При дробном добавлении токсина смесь остается токсичной.
Реакцию нейтрализации токсина антитоксином применяют: 1) для обнаружения и титрования токсина с помощью диагностической антитоксической сыворотки; 2) для выявления и идентификации в сыворотке нейтрализующих антител с помощью стандартного диагностикума.
Реакцию нейтрализации можно поставить в двух вариантах: в организме и в пробирке. В первом случае токсинсодержащие экстракты из выделений, органов больного или продуктов смешивают со стандартными антитоксическими сыворотками и после 30-45 мин экспозиции при комнатной температуре смесь вводят чувствительному животному, чтобы убедиться, что она безвредна. Контрольному животному вводят смесь токсинсодержащих экстрактов и физиологического раствора. Сравнивают эффект в опыте и в контроле. Животные, оставшиеся в живых, при гибели в контроле, свидетельствуют о нейтрализации токсина, содержащегося в исследуемой пробе. Титруют токсин также по методу Эрлиха.
Метод Эрлиха состоит из двух этапов:
1 этап – оттитровывают опытную дозу токсина со стандартной сывороткой. Опытная доза токсина Limes tod – это то количество токсина, которое в соединении с 1 МЕ стандартной сыворотки вызывает гибель морской свинки весом 250 г при подкожном введении на 4-е сутки (или 50% взятых в опыт мышей).
Таблица 8. Определение титра токсина.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.