Микробиология, вирусология, иммунология: Методические указания для самостоятельной работы и к практическим занятиям для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Часть III, страница 20

Титрование антител в сыворотке №2 проводят аналогично.

Через 4 - 6 суток просматривают пробирки, учитывают результат и определяют титр сыворотки. За титр сыворотки принимает то ее наибольшее разведение, которое полностью нейтрализует вирус. Его определяют по пробирке с наибольшим разведением, окрашенным в желтый цвет. Рассчитывают прирост антител в сыворотке №2 по сравнению с сывороткой №1. Достоверным является увеличение титра антител не менее чем в 4 раза.

Реакция торможения гемагглютинации

Реакция торможения гемагглютинации основана на способности противовирусных антител нейтрализовать гемагглютинирующую активность вирусов.

Реакцию ставят в развернутом ряду, используя пластины из органического стекла с лунками.

а) Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) используется для типирования вируса. В качестве антигена берут вирус, выделенный от больного, в качестве антитела – противовирусную диагностическую сыворотку. Перед постановкой РТГА определяют дозу вируса, которая соответствует четырехкратному увеличению титра – 4 АЕ. Титр вируса определяют в реакции гемагглютинации. За 1 АЕ принимают максимальное разведение вируса, дающее гемагглютинацию не менее чем на два плюса.

Таблица 13. Схема РТГА.

№№ пробирок	1	2	3	4	5	6
Разведения аллантоисной жидкости	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	контроль
Физиологический раствор	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-
Аллантоисная жидкость, разв. 1:2	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25 0,25	в дез.р-р -
Физиологический раствор	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,5
1% куриные эмбрионы	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5

          Пластину встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Учитывают результат, определяют 1АЕ и рассчитывают 4 АЕ. Например: 1 АЕ равен 1:32, 4 АЕ равно 1:8.

          После этого ставят реакцию торможения гемагглютинации с типоспецифическими диагностическими противовирусными сыворотками.

          Пластину встряхивают и оставляют при комнатной температуре до оседания эритроцитов в контроле. Учитывают результат. При соответствии типа вируса антителам произойдет торможение гемагглютинации и осадок эритроцитов будет выглядеть также как в контроле сыворотки – в виде «пуговки». Если вирус не соответствует антителам, произойдет гемагглютинация, и осадок эритроцитов будет выглядеть так же, как в контроле вируса – в виде «зонтика».

          По проведенному исследованию делают заключение о типе выделенного вируса.

Таблица 14. РТГА с типоспецифическими сыворотками.

№№ пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8
							контроль
Разведения сыворотки	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	с-ки	вируса
Физиологический раствор	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Сыворотка типа А2 разв. 1:10	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25 0,25	в дез. р-р 0,25         - 1:10
Аллантоисная жидкость 4 АЕ	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-	0,25
Пластину встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре
1% куриные эритроциты	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5

С другими типоспецифическими сыворотками реакция ставится аналогично.

          б) РТГА используется для определения прироста антител в сыворотках больных. В качестве антигена используют стандартные диагностикумы, представляющие собой взвесь эталонных штаммов вируса различных серологических типов. Диагностикум предварительно титруют, определяют 4 АЕ. В качестве антител используют парные сыворотки больных. Сыворотки разводят, к каждому разве­дению сыворотки крови больного, взятой в острый период и в период реконвалесценции, прибавляют равный объем диагностикума в титре 4 АЕ, пластины встряхивают, оставляют на 30 мин при комнатной температуре, после чего добавляют по 0,5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов. Пластину встряхивают и оставляют на 45 мин при комнатной температуре, после чего учитывают результат. Определяют титр сыворотки №1 и №2. Наибольшее разведение сыворотки, которое тормозит гемагглютинацию эритроцитов является титром сыворотки. Четырехкратное и более увеличение титра антител в сыворотке реконвалесцентов свидетельствует о связи перенесенной болезни с данным вирусом.

Реакция торможения гемадсорбции

Реакция торможения гемадсорбции основана на способности антител иммунной противовирусной сыворотки тормозить адсорбцию эритроцитов на клетках культуры ткани, зараженной вирусом. Реакцию применяют, как для типирования вируса, так и для обнаруже­ния антител. Эту реакцию применяют для вирусов, которые, реплицируясь  в клетке не вызывают видимого цитопатического эффекта. Типирование ви­русов проводят с помощью типоспецифических иммунных сывороток. Цельную или слегка разведенную сыворотку смешивают с заражен­ной культурой клеток, предварительно удалив из нее питательную среду, помещают в термостат на 2 часа. Затем вносят в пробирки 0,4% взвесь эритроцитов, опять выдерживают в термостате, встряхивают и изучают под микроскопом с малым увеличением, обращая вниманием на эритроциты, прилипшие к клеткам. Если антитела соответствуют вирусу, на клетках не будет адсорбированных эритроцитов, произой­дет реакция нейтрализации вируса. Тип вируса определяют по той специфической антивирусной сыворотке, которая задерживает гемадсорбцию.

Реакция преципитации