Основы диагностики и терапии антифосфолипидного синдрома, страница 9

Реактивы. 1. Лебетокс, входящий в состав диагностикума "Люпус-тест" фирмы Технология-Стандарт, а также эхитокс того же производителя. Маточные растворы ядовых реагентов готовят за сутки до выполнения анализов следующим образом: во флакон с навесками этих реагентов добавляют 3,0 мл дистиллированной воды и растворяют содержимое при комнатной температуре (+18...+25°С). Растворы оставляют на дозревание при +2...+8°С на 1 сутки. Рабочие растворы реагентов готовят путем смешивания 0,1 мл маточного раствора каждого яда с 2,5-5,0 мл дистиллированной воды. 2. Хлорид кальция, 0,277% раствор.

Ход определения. Лебетоксовый тест. В пробирку вносят 0,1 мл исследуемой БТП и 0,1 мл раствора разведенного яда. Смесь инкубируют 1 мин при +37°С, затем в нее вносят 0,1 мл раствора хлорида кальция 0,277% (+37°С) и регистрируют время свертывания.

Выполнение этого теста должно проводиться лишь на коагулометрах с оптической регистрацией процесса свертывания.

Результат. В норме лебетоксовый тест дает свертывание от 34 до 44 с, в среднем 39,4 с. Замедление свертывания по сравнению с контролем более чем на 20% может быть связано с действием ВА.

Эхитоксовый тест. В пробирку вносят 0,1 мл исследуемой БТП, предварительной прогретой при +37°С в течение 1 мин, затем добавляют в нее 0,1 мл раствора эхитокса (имеющего комнатную температуру) и регистрируют время свертывания. Выполнение данного теста также должно проводиться на оптическом коагулометре.

Результат. В норме по эхитоксовому тесту время свертывания составляет от 31 до 44 с, в среднем 37,6 с. При наличии в плазме ВА время свертывания в этом тесте практически не удлиняется.

2.3. Скрининговый и противовесный тесты протромбиного времени с разведенным тромбопластином

Принцип. Сравнивают результаты ПТВ-тестов, выполненных с реагентами, чувствительными (ПТВ ВА+) и низкочувствительными (ПТВ ВА-) к действию ВА, проведенных с разведенным (ослабленным) тромбопластином.

Реактивы. 1. Тромбопластин-кальциевые реагенты ПТВ(ВА+) и ПТВ(ВА-) фирмы «Технология Стандарт».

Ход определения. По 0,1 мл исследуемой БТП, предварительно прогретой при 37°С в течение 1 мин, смешивают в двух пробирках (кюветах) с 0,2 мл тромбопластин-кальциевого реагента ПТВ(ВА+) и ПТВ(ВА-), имеющих температуру +37°С, и определяют время свертывания. Аналогичным образом определяют время свертывания в контрольной нормальной БТП.

Результат. Нормальные значения в тестах с ПТВ(ВА+) и ПТВ(ВА-) колеблются от 40,6 до 45,1 с.

Наличие в плазме ВА может вести к значительному удлинению времени свертывания в тесте с ПТВ-(ВА+), и незначительному - с ПТВ-(ВА-)-тесте. Это различие незначительно при других причинах удлинения свертывания в протромбиновом тесте.

II этап. Коррекционные (подтверждающие) тесты¹

2.4. Коррекционный тест с компенсирующими фосфолипи-дами

Повторяют удлиненные скрининговые тесты на БТП больного после добавления к последней суспензии разрушенных тромбоцитов или эритрофосфатида.

Реактивы. 1. Те же, что и в скрининговых тестах; 2. Отмытые и разрушенные тромбоциты человека. Готовят следующим образом: стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия кровь (1:9) центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. В полученной богатой тромбоцитами плазме подсчитывают количество тромбоцитов и доводят их количество с помощью трис-HCI буфера (0.05М, рН 7,4) до 100хЮ⁹/л. Затем плазму центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин. Полученные в осадке тромбоциты дважды отмывают в том же буфере, доводя каждый раз объем буфера до первоначального (с учетом разведения буфером) объема плазмы. Суспензию тромбоцитов замораживают при -16...-20°С в течение 20-30 мин и размораживают на водяной бане при температуре +37°С. Процедуру замораживания и оттаивания повторяют трижды. Суспензию разрушенных тромбоцитов разливают по флаконам и хранят при температуре-16...-20°С.

В состав набора реагентов «Люпус-тест» фирмы Технология-Стандарт входит стандартизированный, лиофильно высушенный, компенсирующий тромбоцитарный реагент - "тромбоцитин".