Ход определения. В методиках выполнения АПТВ (ВА+), разведенном лебетоксовом и разведенном протромбиновом ПТВ (ВА+) тестов вместо 0,1 мл БТП исследуется смесь, состоящая из 0,05 мл БТП и 0,05 мл раствора компенсирующих фосфолипидов (из тромбоцитов или эритрофосфатида).
Результат. При наличии ВА в исходно нарушенных скрининговых тестах при добавлении компенсирующих фосфолипидов происходит выраженная коррекция свертывания. При отсутствии коррекции при добавлении фосфолипидов необходимо дополнительно выполнить коррекционный тест с контрольной нормальной БТП (в соотношении 1:1 или 1:4) для исключения дефицита факторов свертывания крови или наличия в плазме их иммунных ингибиторов.
1 Все опытные пробы исследуют параллельно с контрольной нормальной БТП.
2.5. Коррекционный тест с добавлением контрольной нормальной бедной тромбоцитами плазмы
Реактивы. 1. Те же (см. выше). 2. Свежеполученная цитратная БТП здорового человека.
Ход определения. Повторяют нарушенные скрининговые тесты после смешивания БТП больного с контрольной нормальной БТП в пропорции 1:1 или 1:4). Для анализа используют 0,1 мл этой смеси. Важно при этом, чтобы до выполнения того или иного теста смесь хранилась не более 2-3 мин.
Результат. При гипокоагуляции, обусловленной ВА, добавление нормальной БТП не нормализует время свертывания в скрининговых тестах. В отличие от этого, при гипокоагуляции, связанной с дефицитом плазменных факторов свертывания, происходит нормализация показаний тестов.
При наличии в плазме больного ингибиторов плазменных факторов свертывания коррекция (укорочение времени свертывания) отсутствует в обоих коррекционных тестах (с компенсирующими фосфолипидами и добавлением контрольной нормальной БТП).
2.6. Определение волчаночного антикоагулянта по прокоагу-лянтной активности плазменных фосфолипидных мембран
Принцип. Тест основан на определении каолинового времени (KB) свертывания БТП до и после удаления из нее методом микрофильтрации плазменных фосфолипидных мембран (ПФМ). По этим данным рассчитывают индекс прокоагулянтной активности ПФМ в %. В методе учитывается свойство ВА снижать прокоагулянтную активность ПФМ.
В норме индекс активности ПФМ составляет в среднем 99,8+0,9% и варьирует в пределах 72-127 %. У больных с ВА в 83% случаев определяется снижение активности ПФМ в плазме в среднем до 55% (от 0 до 70%), что связано с блокадой коагуляционно активных мембран бимодальными антифосфолипидными антителами. Более точная диагностика может быть проведена описанным ниже способом.
Принцип. Определение ВА проводится по угнетению прокоагулянтной активности нормальных плазменных фосфолипидных мембран бедной тромбоцитами плазмой больного. Внесение в профильтрованную БТП больного нормальных ПФМ сопровождается угнетением прокоагулянтной активности этих мембран АФА. Схема анализа представлена на рис. 3.
Реактивы и оборудование. 1. Трис-HCI буфер, 0.05М, рН 7.4
Рис. 3. Схема определения ВА по методу, использующему микрофильтрацию плазмы.
(после приготовления пропускается через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм). 2. Каолин (легкая фракция), в концентрации 0,25 мг/мл. 3. 0.025М раствор хлорида кальция. 4. Фильтры с диаметром пор 0,2 мкм "Minisari-RS15 SM177610Q" фирмы "Sartorius" (Германия) в полипропиленовой оправе со шприцами для фильтрации.
Приготовление исследуемых образцов плазмы и получение из них ПФМ
Для получения анализируемых проб и их тестирования по каолиновому времени требуется по 2,5 мл БТП контроля и больного, а также три фильтра.
1. Получение нормальной БТП, лишенной ПФМ. Фильтруют 1,0 мл нормальной БТП (эту профильтрованную плазму обозначают как проба № 1).
2. Получение нормальной БТП после возврата в нее собственных ПФМ. Для этой цели фильтр, который был использован при приготовлении пробы №1, промывают 3,0 мл буфера, а затем переворачивают и пропускают через него 1,0 мл контрольной БТП, вследствие чего происходит возврат осажденных на фильтре ПФМ в ранее профильтрованную плазму (проба № 2 - контрольная).
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.