3. Получение плазмы больного, лишенной ПФМ. Для этой цели фильтруют 1,0 мл БТП исследуемого больного через чистый фильтр, удаляя из нее ПФМ (полученная плазма обозначается как проба №3).
4. Добавление ПФМ, полученных из контрольной плазмы в профильтрованную плазму больного. Для этого фильтруют 1,0 мл нормальной БТП через чистый фильтр, чем достигается осаждение ПФМ контроля на фильтре. Для удаления остатков плазмы фильтр, с задержанными на нем ПФМ контроля, промывают 3,0 мл буфера. Затем фильтр переворачивают и пропускают через него 1,0 мл плазмы больного, смывая нормальные ПФМ. В результате происходит перемещение осажденных на фильтре нормальных ПФМ в профильтрованную плазму больного (проба № 4).
Ход определения. Инкубируют все четыре пробы в течение 120 мин при комнатной температуре (+18...+25°С), а затем определяют KB свертывания в этих пробах. Для этого 0,1 мл из каждой исследуемой пробы смешивают с 0,1 мл взвеси легкого каолина, инкубируют 3 мин при +37°С, после чего добавляют в смесь 0,1 мл раствора хлорида кальция и регистрируют время свертывания.
KB в пробе №1 обозначают как t1.
KB в пробе №2 обозначают как t2.
KB в пробе №3 обозначают как t3.
KB в пробе №4 обозначают как и.
Оценка результатов. На основе проведенных определений рассчитывают исходную прокоагулянтную активность ПФМ в контрольной плазме (Чй) по формуле1:
X1 ,%= 103.8(lg1-lg2)
Затем также рассчитывают прокоагулянтную активность контрольных ПФМ (Х2) после их инкубации с плазмой больного по фор' Формула рассчитана на основе калибровочных графиков, полученных при исследовании образцов плазмы с разным уровнем прокоагулянтной активности ПФМ.
муле:
Х2,% = 103,8(lgt3-lgt4)+1.
Вычисляют остаточную активность (ОА) контрольных ПФМ в профильтрованной плазме больного по формуле:
eW(%) = l1/l2x100%.
Степень подавления прокоагулянтной активности нормальных ПФМ антителами, содержащимися в плазме больного, соответствует активности волчаночного антикоагулянта в профильтрованной БТП больного. В контрольных исследованиях ОА находится в пределах 85-115%.
Пример. При исследовании по данной методике больного с ВА получены следующие значения KB:
1) в пробе №1 -152 с (t1,),
2) в пробе №2 - 84 с (t2),
3) в пробе №3 - 240 с (t3),
4) в пробе №4-180 с (t4).
Исходная прокоагулянтная активность ПФМ (Чй) составила:
X1, % = 103.8(lg152-lg84)+1 = 95%
Прокоагулянтная активность ПФМ (Х2) контроля после их инкубации с плазмой больного составила:
X2i %== 103.8(lg240-lg180)+1 = 30%
Остаточная активность ПФМ контроля оказалась равной:
30
е W(%) = — х 100% = 32%. 95
Результат: анализ на ВА положительный.
2.7. Определение антифосфолипидных антител (к кардиоли-пину, фосфатидилсерину, фосфатидилэтаноламину)
Большинство антифосфолипидных антител, определяющих развитие АФС, принадлежат к классу IgG, реже - IgM или еще реже -IgA. Основная часть этих антител, показывающая при этом наилучшую корреляцию с клинической картиной АФС, относится к классу IgG. Диагностическое значение определения lgM-антител меньшее.
Ниже приводится описание методик иммуноферментного определения аутоантител к фосфатидилсерину и кардиолипину на примере использования диагностикумов "Anti-PhosphatidylSerineIgG/IgM" и "Anti-CardiolipinIgG/IgM" фирмы ВСМ Diagnostics ORGen-Tec (США, Германия).
•
Принцип. Метод определения АФА основан на принципе твердофазного иммуноферментного анализа. На поверхности лунок мик-ротитровального планшета иммобилизован антиген - фосфатидил-серин (или кардиолипин). При добавлении в лунки разведенной сыворотки больного (калибраторов и контрольных образцов сыворотки) присутствующие в ней антитела связываются с соответствующим антигеном. После инкубации планшет промывают, удаляя несвязанный материал. Связавшиеся с твердой фазой антитела к фосфати-дилсерину определяют, добавляя в лунки меченые пероксидазой антитела против IgG или IgM (в каждом образце необходимо определить оба класса антител)1. В результате после инкубации ферментный конъюгат взаимодействует с антителами соответствующего класса, иммобилизованными на твердой фазе. Не связавшиеся антитела и белки плазмы удаляются промыванием.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.