В лунки вносят субстрат для пероксидазы - тетраметилбензидин, который в присутствии фермента окрашивается в синий цвет2. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты. На вертикальном спектрофотометре измеряют интенсивность окрашивания при длине волны 450 нм3. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации антифосфолипидных антител. Результаты выражают в условных ед/мл, согласно классификации и стандартам Харриса (используют калибратор).
Реактивы при определении аутоантител к фосфатидилсери-ну. 1. Ферментный конъюгат. Готовый раствор антител против IgG и IgM, конъюгированных с пероксидазой хрена. 2. Калибраторы на IgG и IgM (маркированы в ед/мл). 3. Контрольные сыворотки (положительная и отрицательная) на IgG и IgM, концентрация антител указана в инструкции к набору. Перед использованием сыворотки разводятся в пропорции 1:100 растворителем для образцов. 4. Промывочный буфер, концентрированный. Разводится дистиллированной водой до объема 600 мл. 5. Растворитель для образцов - 2x25 мл, готов к использованию. 6. Субстрат, содержит тетраметилбензидин -готовый для использования раствор. 7. Останавливающий раствор
1 В тест-системе на антикардиолипин используются антитела против IgG, IgM и IgA, конъюгированные с щелочной фосфатазой.
2 При определении антител к кардиолипину субстратом служит пара-нитрофенил-фосфат.
3 В соответствии с интструкцией к тест-системе измерение проводит при 405 нм.
(0,25М серная кислота) - готовый к использованию. 8. Планшет (мик-рострипы) - 96 лунок. Каждый из 12 стрипов содержит 8 съемных лунок, покрытых фосфатидилсерином, выделенным из спинного мозга быка.
Реактивы при определении аутоантител к кардиолипину 1. Конъюгат. Готовый раствор козьих антител против IgG, IgM и IgA человека, конъюгированных с щелочной фосфатазой. 2. Калибратор. Содержит сыворотку человека, позитивную по антителам к кардиолипину (маркирован в ед/мл). 3. Положительный контроль. Содержит сыворотку человека, позитивную по антителам к кардиолипину. Концентрация антител указана на этикетке. 4. Отрицательный контроль. 5. Промывочный буфер (фосфатно-солевой, рН 7,4), концентрированный. Разводится дистиллированной водой до 1 л. 6. Буфер для разведения проб, 60 мл готового к применению раствора. 7. Субстрат для щелочной фосфатазы - пара-нитрофенилфосфат. Готовый к применению раствор. 8. Стоп-реагент. Готов к использованию. 9. Планшет плоскодонный 96-луночный. Каждый из 12 стрипов содержит 8 съемных лунок, покрытых антигеном - кардиолипином.
Специальное оборудование. Для выполнения исследования необходимы вертикальный фотометр для планшетов (типа "Мультискан" или "Униплан") с фильтром на 450 нм, а также автоматические микропипетки со сменными пластиковыми наконечниками, обеспечивающими дозирование растворов от 5 до 1000 мкл. Упрощает исследование использование многоканальных пипеток.
Материал для исследования. Сыворотка крови (должна быть получена не позднее 4 ч от момента забора крови). Допускается хранение отделенной от сгустка сыворотки в течение 72 ч при +2...+8°С или 3 месяца при температуре -20 °С. Повторное оттаивание и замораживание не допускаются. Пробы с гемолизом, гиперли-пидемией и микробно загрязненные не исследуются.
Ход определения. 1. Калибраторы, контроли и сыворотку больных разводят растворителем в соотношении 1:100. 2. Вносят в соответствующие лунки стрипов планшета по 100 мкл калибратора, разведенных контролей и образцов. В качестве калибратора и положительного раствора используют либо IgG, либо IgM (рекомендуется проводить тест в дупликатах). В одну лунку, по которой устанавливается бланк фотометра, вносят 100 мкл растворителя для образцов. Для каждого класса иммуноглобулинов должна быть предусмотрена своя лунка с бланк-контролем, в которую надо будет добавить соответствующий ферментный конъюгат. 3. Инкубируют 30 мин, при
30
З.С. Баркаган, АЛ. Момот, Г.В. Сердюк, Л.П. Цывкина
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.