Основы диагностики и терапии антифосфолипидного синдрома, страница 8

Получение бедной тромбоцитами плазмы. Согласно международным рекомендациям, для получения БТП на I этапе кровь центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин. Затем плазма дополнительно центрифугируется 5 мин при 10 000 g, после чего ее следует сразу же исследовать, хотя она может сохраняться при -20°С в течение 2 недель или при -80°С еще более длительно. Однако указанный выше регламент получения БТП не доступен большинству клинических лабораторий и чреват разрушением клеток крови, нарастанием в плазме количества фосфолипидных мембран. И лишь при ультрацентрифугировании (на II этапе) избыток этих мембран удаляется из плазмы.

Учитывая все эти сложности, в нашем центре была отработана следующая упрощенная и достаточно надежная методика получения БТП.

Стабилизированную кровь центрифугируют при 1000 об/мин (140-160 g) в течение 5-7 мин. При этом уточняют число об/мин в соответствии с радиусом ротора центрифуги (рис.2). Богатую тромбоцитами плазму с помощью пипетки переносят в другую пробирку, в которой ее дополнительно центрифугируют при 3000-4000 об/мин (1200-1400 g) в течение 15 мин. Такой режим обеспечивает достаточно полное удаление тромбоцитов из плазмы ( 97-99%) без существенного увеличения в ней ФМ. Центрифугирование проводят при комнатной температуре (+18...+25°С). БТП подвергают исследованию в течение последующих 1-2 ч.

Точность диагностики значительно возрастает при определениях эффектов ВА на оптических коагулометрах, особенно при выполнении тестов с использованием змеиных ядов. С этой целью в нашем центре с успехом были испытаны коагулометры следующих фирм: Organon Teknika (Coag-a-Mate ЧМ), Behnk Elektronik (Thrombotimer), DiaMed (CD-4) и Юнимед (Минилаб 701).

I этап. Скрининговые и противовесные тесты

На БТП выполняются все фосфолипид-зависимые и противовесные тесты (см. схему на рис. 1).

Использование таких парных (скрининговых и противовесных) тестов существенно повышает точность диагностики. Следует лишь иметь в виду, что диагностика может считаться достаточно обоснованной, если выполняются все парные тесты.

2.1. Скрининговый и противовесный АПТВ-тесты Принцип. Сравнивают результаты АПТВ-тестов, выполненных с реагентами, чувствительными (АПТВ ВА+) и малочувствительными (АПТВ ВА-) к действию ВА.

Различие показаний в этих тестах не выявляется при других причинах удлинения гемокоагуляции, в частности, при дефиците факторов свертывания, наличии их ингибиторов и при лечении антикоагу

Рис. 2. Номограмма для определения режима центрифугирования.

лянтами. При всех этих ситуациях имеются близкие результаты ги-покоагуляционного сдвига в АПТВ(ВА+) и АПТВ(ВА)-тестах.

Реактивы. 1. АПТВ (ВА+) и АПТВ (ВА-) - реагенты фирмы Технология-Стандарт. Разводятся согласно инструкции. 2. Хлорид кальция 0,277% раствор.

Ход определения. 0,1 мл исследуемой бедной тромбоцитами плазмы смешивают с 0,1 мл АПТВ (ВА+) реагента, инкубируют 3 мин при температуре +37°С, после чего добавляют 0,1 мл рабочего раствора хлорида кальция (+37°С) и определяют время свертывания. Аналогичным образом определяют время свертывания с АПТВ(ВА-) реагентом. Параллельно определяют с этими же реагентами время свертывания в контрольной нормальной БТП.

Результат. Замедление свертывания в тесте с АПТВ(ВА+) по сравнению с контролем и показаниями теста с АПТВ(ВА-) более чем на 20% может быть связано с действием ВА.

2.2. Скрининговый и противовесный тесты с использованием разведенных ядов гюрзы (лебетокс) и эфы (эхитокс)

Принцип. Основан на параллельном выполнении и сопоставлении результатов фосфолипидзависимого теста с разведенным ядом гюрзы (лебетоксовый тест) и фосфолипиднезависимого теста с ядом эфы (эхитоксовый тест).

Наличие в плазме ВА ведет к удлинению времени свертывания в тесте с лебетоксом (ВА+) при не отличающихся от нормы значениях эхитоксового теста (ВА-).