Основы диагностики и терапии антифосфолипидного синдрома, страница 6

С учетом всех этих наработок нами предлагается следующий алгоритм распознавания эффектов ВА (рис. 1).

В верхней части схемы представлены парные скрининговые и противовесные тесты, а в нижней - коррекционные (подтверждающие) определения.

К числу скрининговых тестов относят и каолиновое время свертывания БТП. Однако данный метод лишен специфичности, но помогает провести дифференциацию эффектов ВА с действием ингибиторов внутреннего механизма свертывания.

Ill этап - Иммунологические тесты (принцип Harris, 1987)

Определение антител к кардиолипину, фосфатидилсерину и фосфатидилэтаноламину, наряду с определением ВА и степени блокады плазменных фосфолипидных мембран в фильтрационном тесте, также используется в диагностике АФС. Выполнение этих тестов необходимо в случаях невыявления АФА со свойствами ВА, что наблюдается у 20-40% больных с АФС [51, 52, 70].

Для указанных определений применяют три типа тест-систем:

•                                           определения антикардиолипиновых антител;

•                                           определения антител к фосфатидилсерину;

•                                           определения антител к другим отрицательно заряженным фос-фолипидам.

Помимо этого можно дополнительно определять титры антител к белкам, связанным с ФМ В₂-гликопротеину 1, аннексину V и протромбину.

АФА могут принадлежать к классам IgG и IgM, изредка IgA. Основная часть этих антител, показывающая при этом наибольшую корреляцию с клиникой АФС, относится к классу IgG. Диагностическое значение определения lgM-антител намного меньше.

Определения всех этих АФА осуществляется иммунологически с тест-системами «IBL», «Stago», «Hyphen BioMed», «IMMCO diagnostics».

Метод определения АФА основан на принципе твердофазного иммуноферментного анализа. На поверхности лунок микротитро-вального планшета иммобилизован антиген фосфатидилсерин (или кардиолипин). При добавлении в лунки разведенной сыворотки больного (калибраторов и контрольных образцов сыворотки) присутствующие в ней антитела связываются со своим антигеном. После инкубации планшет промывают, удаляя несвязанный материал. Связавшиеся с твердой фазой антитела к фосфатидилсерину определяют, добавляя в лунки меченые пероксидазой антитела против IgG или IgM (в каждом образце необходимо определять оба класса антител)¹. В результате после инкубации ферментный конъюгат

¹ В тест-системе на антикардиолипин используются антитела против IgG, IgM и IgA, конъюгированные со щелочной фосфатазой.

взаимодействует с антителами соответствующего класса, иммобилизованными на твердой фазе. Несвязавшиеся антитела и белки плазмы удаляют промыванием.

В лунки вносят субстрат для пероксидазы - тетраметилбензидин, который в присутствии фермента окрашивается в синий цвет¹. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты. На вертикальном спектрофотометре измеряют интенсивность окрашивания при длине волны 450 нм². Интенсивность окраски пропорциональна концентрации определяемых антифосфолипидных антител. Результаты выражают в условных ед/мл, согласно классификации и стандартов Харриса (используют калибратор).

Следует учитывать, что, согласно обширным контрольным испытаниям, нет полного совпадения (конкордантности) разных методов определения АФА, как и их принадлежности к тем или иным иммуноглобулинам. В частности, результаты иммунологического определения только кардиолипина нередко бывают неинформативными. Поэтому желательно комплексное определение по крайней мере двух или трех видов таких антител (например, к кардиолипину, фосфатидилсерину и/или фосфатидилэтаноламину), принадлежащих к классам IgG и IgM. Следует также учитывать, что определения АФА, обладающих и не обладающих свойствами ВА, могут не совпадать друг с другом. По имеющимся сведениям свойствами ВА обладает около 70% АФА, вызывающих АФС (Asherson et al., 1996). Необходимо учитывать и то, что наиболее «ходовое» и стандартизированное определение, каковым является антикардиолипиновый тест, наименее специфично, поскольку кардиолипин - компонент не клеточных мембран, а мембран митохондрий. В заблокированном виде он содержится в достаточно большом количестве и в плазме здоровых людей (В.А. Саенко, Г.М. Ротт, A.M. Поверенный, 1989). Поэтому для получения более надежных результатов и исключения ложнопо-ложительного антикардиолипинового теста используются иммуно-ферментый анализ и метод иммунофлюоресценции. Вместе с тем известно, что и при достаточно полном иммунологическом обследовании более 55% случаев АФС остается нераспознанным.