По окончании синтеза удаляют щелочной обработкой защитные группы с гетероциклов, с фосфита и отщепляют синтезированный олигонуклеотид от полимера.
Для указанных нами ранее методов анализа (ПЦР и гибридизации) требуются олигонуклеотиды, несущие дополнительный фрагмент ненуклеотидной природы - репортерную группу,выявляемую ферментативно или физическими методами, Наиболее распространены зонды ДНК, меченые изотопами 32 P, 125 I и позволяющие достигнуть высокой чувствительности. Однако широкое применение таких зондов, в особенности в клинической практике,ограничено из
-за их нестабильности и радиационной опасности. В связи с этим в настоящее время проводятся многочисленные исследования, направленные на создание зондов, которые можно определять нерадиохимическими методами. Чаще всего используют биотиновую и флуоресцентную метки [4, 5].
Выявление биотинового производного основано на том, что биотин - природный кофактор группы ферментов - карбоксилаз способен образовывать прочный комплекс с белком авидином (или стрептавидином). Биотиновую метку обнаруживают с помощью конъюгатов авидина с ферментом в присутствии соответствующего окрашенного субстрата.
В синтетический олигонуклеотид остаток биотина можно ввести:
- по концевому фосфату, предварительно присоединив к нему фрагмент,содержащий аминогруппу;
- в такие положения гетероциклических оснований, которые не принимают непосредственного участия в комплементарных взаимодействиях.
Предпочтительнее являются химические подходы, направленные на создание производных в виде соответствующих мономеров, которые можно сразу добавлять в автоматический синтез.
Рассмотрим получение сетей Петри синтезов модифицированных олигонуклеотидов.
В работах [4, 73] предложен синтез амидофосфитов (p20, p24)
(рис. 4.7). Указанные амидофосфиты получены (t7, t9) при обработке 2-(9-флуоренилметоксикарбонил)-аминоэтанола (p23)
(синтезированного (t8) в свою очередь из этаноламина (p21) и
9-флуоренилметилформиата (p22)) и N-трифторацетил-2-аминоэтанола
(p19) соответственно избытком 2-цианоэтил-N,
N-диизопропиламинохлорфосфита (p18).
2-цианоэтил-N,N-диизопропиламинохлорфосфит (p18) получали при взаимодействии (t6) диизопропиламина (p15) и
2-цианоэтил-дихлорфосфита (p16). В результате взаимодействия
(t11, t12) реагентов (p20, p24) с олигонуклеотидом (p13) (см.
рис. 4.6) образован аминоалкилолигонуклеотид (p29), способный превращаться (t13) в Bio-олигонуклеотид (p30) при обработке N
-оксисукцинимидным эфиром биотина (p28), полученным из биотина
(p25) и N-гидроксисукцинимидного эфира (p26) в присутствии конденсирующего агента N,N-дициклогексилкарбодиимида (p27).
Аналогично можно использовать в автоматическом синтезе амидофосфиты (р35,р36) (рис. 4.8). N-монометокситритил- 2-аминобутил(2-цианоэтил)-N,N-диизопропиламино-амидофосфит (р36)
получен (t18) из N-монометокситритиламинобутанола (p33) и
2-цианоэтил-бис(N,N-диизопропиламино)фосфита (p17). Монометокситритиламинобутанол (p33), в свою очередь, синтезировали (t14) из аминобутанола (р31) и монометокситритилхлорида (p32). При взаимодействии (t17) 2-(биотиниламидо)бутанола (p34) и фосфита
(p17) получается N-биотинил-2аминобутил-(2-цианоэтил)-N,N
-диизопропиламиноамидофосфит (p35). 2-(биотиниламидо)-бутанол
(p34) можно получить двумя путями: взаимодействием (t15,t16)
аминобутанола (p31) либо с N-оксисукцинимидным эфиром биотина
(p28), либо с биотином (p25). Синтез N-оксисукцинимидного эфира биотина (p28,t10) и 2-цианоэтил-бис-(N,N-диизопропиламино)
фосфита (p17,t6) аналогичен предыдущему примеру (см. рис. 4.7).
Преимущество биотинилированного амидофосфита (p36) заключается в том, что можно сразу в ходе автоматического синтеза получить Bio
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.