предлагается использовать систему интеллектуального проектирования. Исходными данными для работы интеллектуального проектировщика являлись схемы химического синтеза. Множеству переходов сети Петри ставились в соответствие химические реакции, а множеству позиций - химические реагенты, как было предложено Питерсоном. Входные функции переходов определялись исходными веществами реакций, а выходные функции - веществами, полученными в ходе синтеза. Поскольку реакции не уравниваются, то кратность позиций принималась равной единице. В сети Петри, полученной в результате объединения схем, описывающих 8
различных методик синтеза биотинилированных олигонуклеотидов, содержится 68 позиций и 39 переходов.
Олигонуклеотидный синтез - это связывание специфических нуклеотидов, в результате которого образуется мультимер определенной длины и последовательности. Каждый синтез включает в себя серии циклов связывания, причем за каждый цикл добавляется один нуклеотид. Цикл связывания состоит из множества этапов-процедур. Синтез олигонуклеотидов представляет собой серии органических химических реакций, проходящих в безводных условиях, и основывается на конденсации между гидроксильной группой в 5' положении одного нуклеотида и фосфатной группой второго нуклеотида. В синтезе используется химия защитных групп.
Различные части нуклеотидных молекул защищаются специальными химическими группировками, которые позволяют проводить специфическое связывание и получать нужную последовательность. К
настоящему времени разработаны быстрые методы получения олигонуклеотидов с помощью автоматических ген-синтезаторов. Эти способы основаны на ступенчатом присоединении мономеров к растущей олигонуклеотидной цепи, связанной с нерастворимым полимерным носителем, находящимся в колонке синтезатора.
На рис. 4.4 представлен ген-синтезатор Pharmacia LKB Gene
Assembler Plus. Управляется синтезатор компьютерной программой.
По программе через колонку пропускают поочередно необходимый на данной стадии мономер, растворы окислителя и кислоты, а в промежутке между ними промывающие растворы. Весь цикл занимает несколько минут. В начале программы задают последовательность олигонуклеотидов, количество синтезов, минимальную эффективность связывания. В данном синтезаторе используется наиболее распространенный фосфитамидный метод, в котором мономерами являются фосфоамидиты, представленные на рис. 4.5.
Рассмотрим получение сети Петри стандартного твердофазного олигонуклеотидного синтеза (рис. 4.6).
Цикл синтеза состоит из 4 основных этапов.
1.Удаление (t1) раствором трихлоруксусной кислоты (p2)
защиты (DMTr) с 5'-гидроксильной группы концевого
2-деоксирибозного звена (p1) и активация
(t2) мономера-фосфоамидита (p4) в присутствии нуклеофильного катализатора - тетразола (p5).
2. Конденсация (t3) фосфоамидита (p6) с 5'-оксигруппой последнего звена олигомера,связанного с носителем (p3). В
результате образуется фосфит (p7).
3. Непрореагировавшие 5'-гидроксильные группы (p8)
кэппируют (t5) смесью уксусного ангидрида (p10),
4-диметиламинопиридина (DMAP) (p11) и 2,4,6-коллидина (p9).
Таким образом,только цепь с правильной последовательностью будет наращиваться на последующих стадиях.
4.Образовавшийся фосфитный триэфир (p7) окисляют (t4) до более устойчивого фосфатного триэфира (p13) смесью иода (p12) и коллидина (p9).
В конце линии синтезатора расположен монитор, детектирующий
DMTr ионы после детритилирования по окончании каждого цикла.Информация из монитора автоматически интегрируется и используется для вычисления эффективности связывания. Если эффективность связывания окажется ниже заданной величины, синтез будет временно остановлен до решения исследователя.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.