Возбудители особо опасных и зоонозных инфекций, энтеробактерий. Часть IV: Методические указания к практическим занятиям, страница 13

Используемые        тесты	Биовары
	Классические вибрионы	Эль-Тор
Лизабельность фагом С	+	-
Лизабельность фагом Эль-Тор 2	-	+
Гексаминовый тест	-	+
Агглютинация куриных эритроцитов	-	+
Содо-сывороточная агглютинация	-	+
Реакция Фогес-Проскауэра	-	+
Чувствительность к полимиксину	+	-

Эти реакции не абсолютны, поэтому их ставят и учитывают в комплексе.

От больных или вибриононосителей могут быть выделены куль­туры слабо агглютинирующиеся или неагглютинирующиеся 0-сывороткой (НАГ-вибрионы). Установлена роль последних в этиологии острых кишечных инфекций. Они похожи по культуральным, морфологическим и ферментативным свойствам, имеют общий с ними Н-антиген, но при­надлежат к другим серологическим 0-группам.

У таких культур более подробно изучаются биохимические свойства. Ставят пробы, подтверждающие принадлежность к роду vibrio: пробу Хьо-Лейфсона, оксидазную активность, декарбоксилазы аминокислот, протеолитическую и диастатическую активность, нитрозоиндоловую реакцию, гемолиз бараньих эритроцитов и т.д.

Холерные вибрионы образуют индол и восстанавливают нитраты в нитриты (положительная нитрозо-индоловая проба), обладают хорошо выраженной диастатической активностью (разлагают крахмал в пита­тельной среде через б часов), протеолитической (разжижают жела­тин),  декарбоксилазной активностью, не растворяют эритроциты ба­рана,  оксидазоположительны.

Для ускоренной бактериологической диагностики применяют ме­тод иммунофлюоресценции, метод иммобилизации и микроагглютинации в фазовом контрасте.

Чтобы ускорить идентификацию выделенных вибрионов, использу­ют систему индикаторную бумажную (СИБ). СИБ представляет собой набор реактивов для определения оксидазы, уреазы, индола, декарбоксилаз аминокислот, сахаролитических свойств, смешанных с инди­катором, нанесенных на кружки бумаги и высушенных. Выделенную культуру вносят в пробирки с системой и через 6 часов оценивают результат.

Серологический метод

Серологический метод диагностики основан на обнаружении ан­тител к холерным вибрионам. Этот метод позволяет установить лег­кие и неясные случаи болезни. При постановке серологического ди­агноза целесообразно исследовать парные сыворотки с интервалом в 6-8 дней, Для обнаружения антител ставят реакцию агглютинации. Диагноз может быть поставлен, если реакция положительна в высо­ком титре (1:1800). Ставят также реакцию лизиса на определение нарастания титра вибриоцидных антител Динамика нарастания титра

агглютининов и вибриоцидных идет параллельно, но реакция на вибриоцидные антитела считается более чувствительной.

          При оценке положительных результатов необходимо учитывать, что нарастание титра антител наблюдается и при вакцинации.

       2. Изучение этапов бактериологического исследования  испражнения больного, подозрительного на холеру или вибрионосительство.

 а) изучение роста на 1% пептонной воде. Обратить внимание на наличие или отсутствие пленки на поверхности среды. При отсутствие  пленки произвести пересев на 1% пептонную воду и щелочной агар. При наличии пленки , из нее приготовить мазок и раздавленную каплю и поставить реакцию микроагглютинации по следующей методике : на предметное стекло по капле нанести холерных О- и Н-сывороток, в обе капли внести по одной петле культуры из пленки, после чего закрыть покровным стеклом и микроскопировать с иммерсионной системой или в фазовом контрасте. При положительной реакции наблюдают отсутствие подвижности культуры и склееные микробные клетки.

б) Изучение посева на щелочном агаре. Отобрать колонии, подозрительные на возбудителя холеры и изучить их. Обратить внимания на :

1) Внешний вид(размеры, формы, цвет, прозрачность, характер поверхности и края, консистенцию).

2) Из части отобранной колонии приготовить мазки и раздавленную каплю,  изучить морфологию, отношение к окраске по Граму, подвижность.

3) Для изучения антигенных свойств выросшие культуры из той же колонии поставить ориентировочную  реакцию агглютинации на стекле с холерными О- и Н-сыворотками.

4) Для выделения и изучения чистой культуры произвести посев из колонии на лактозосахарозную  среду, скошенный агар, МПБ, среду с крахмалом.

в) Изучение выделенной культуры вибриона на скошенном агаре

1. Макроскопическое: описать характер роста, его цвет, прозрачность, поверхность.

2. Микроскопическое: изучит морфологию клеток в мазке , окрашенном по Граму   и подвижность в раздавленной капле.

3. Для изучения ферментативных свойств выделенной культуры произвести пересев со скошенного агара на пестрый ряд. По схеме Гейберга используют три углевода: арабинозу, сахарозу, маннозу.        

Изучить ферментативные свойства выделенной культуры по  демонстрационному пестрому ряду. Результаты зафиксировать в протоколе по схеме: 

Сахароза	Манноза	Арабиноза

По таблице определить биохимическую группу по Гейбергу и записать вывод.

4) Определить диастатическую активность культуры. Для этого  в засеянную пробирку со средой Кодама (среда с крахмалом ) и контрольную (без посева культуры) добавить несколько капель раствора люголя. При отрицательной пробе на диастазу содержимое опытной пробирки, так же как и контрольной, окрашивается в синий цвет. При разложении крахмала синего окрашивания среды не происходит.

5) Антигенные свойства выделенной культуры изучить путем постановки развернутой реакции агглютинации с О и Н-холерными сыворотками, начиная с разведения 1:100 (титр 1:8000). Антигеном в реакции служит исследуемая культура, которую заливает физиологическим раствором в объеме 2-3 мл., хорошо суспензируют и по две капли вносят в пробирки с приготовленным разведением. Реакцию на 2 часа помещают в термостат при температуре 37⁰С и 18-20 часов выдерживают при комнатной температуре.