Возбудители особо опасных и зоонозных инфекций, энтеробактерий. Часть IV: Методические указания к практическим занятиям, страница 12

Независимо от результатов исследования производят пересев на вторую пептонную воду и на чашки с простым и селективным агаром.

Характерный рост на 1% пептонной воде, типичная морфология и агглютинабельность холерной 0-сывороткой позволяют выдать первый ориентировочный ответ.

Третий этап

Через 12-14 часов изучают колонии, выросшие при посеве мате­риала на плотных питательных средах, а также характер роста на второй среде накопления, выполняя те же исследования, что и при изучении первой среды накопления.

С плотной среды отбирают 2-5 колоний, подозрительных на ко­лонии холерного вибриона. На щелочном агаре холерный вибрион об­разует гладкие    круглые плоские прозрачные голубоватые в проходя­щем свете колонии диаметром 2 мм. Консистенция колоний маслянис­тая, они легко   эмульгируются в физиологическом растворе. При осмотре под малым увеличением микроскопа колонии имеют гомогенную структуру, окрашены в светло-желтый цвет.

Из отобранных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и изучают морфологию микроба. Изучают подвижность культуры в вися­чей или раздавленной капле,  ставят ориентировочную реакцию агглю­тинации на стекле с холерной 0-сывороткой и типовыми сыворотками Огава и Инаба. Положительная реакция агглютинации у типичных по морфологии и культуральным свойствам вибрионов дает право выдать предварительный положительный ответ о выделении грамотрицательных вибрионов, агглютинирующихся холерной О-сывороткой.

Часть колоний при положительной реакции агглютинации отсе­вают на скошенный агар для выделения чистой культуры, а также в пробирку с МПБ и на комбинированные среды (лактозосахарозную,. Клиглера). Бульонную культуру инкубируют 4 часа, остальные остав­ляют в термостате на более длительное время.

С молодой бульонной культурой ставят развернутую реакцию агглютинации, проверяют ферментативные свойства для определения группы Гейберга и фаголизабельность холерными фагами.

 Четвертый этап

Учитывают развернутую реакцию агглютинации, реакцию фаголизиса, расщепление углеводов.

Изучают чашки с посевами из второй пептонной воды,  также как чашки с посевом нативного материала.

Изучают посевы на скошенном агаре при появления видимого роста, но не позднее 10-12 часов после посева, рост на лактозосахарозной среде. Типичное поведение культуры на этой среде (ферментация сахарозы и отсутствие разложения лактозы) является основанием для её дальнейшего изучения и идентификации.

Объем исследований по идентификации культур зависит от цели исследования : необходимость определения культуры только до ви­да      Vibrio cholerae ;  детальная характеристика культуры с опре­делением серовара (Огава, Инаба, Гикошима); биовара (Эль-Тор, классический).

Для определения вида достаточно полученных результатов по изучению морфологических свойств, подвижности, характера роста на питательных средах, сахаролитических и антигенных свойств.

При выделении типичных колоний на простых средах положитель­ный ответ может быть выдан через 18-36 часов, при отборе типич­ных колоний только с селективных сред этот срок увеличивается. Отрицательный ответ может быть дан через 24-48 часов.

Идентификация вибрионов

Морфологические свойства и подвижность изучают на всех эта­пах исследования.

Ферментативные свойства изучают для определения группы Гейберга. Для этого делают посев культур на среды с сахарозой, маннозой, арабинозой. По отношению к этим углеводам Гейберг разде­лил вибрионы на 8 ферментативных групп.

Группа	Сахароза	Манноза	Арабиноза
I	+	+	-
П	-	+	-
Ш	+	+	+
IY	-	+	+
Y	+	-	-
УХ	-	-	-
УП	+	-	+
УШ	-	-	+

Классические холерные вибрионы и вибрионы Эль-Тор относят­ся  к I группе Гейберга. Они  расщепляют маннозу и сахарозу до кислоты и не ферментируют арабинозу.

Определение фаголизабельности выделенных культур проводят диагностическими холерными фагами  С и Эль-Тор методом Грациа. Чувствительность к холерным фагам позволяет дифференцировать и биовары холерных вибрионов.

Чтобы изучить антигенные свойства выделенной культуры и определить видовую принадлежность вибрионов, ставят развернутую реакцию агглютинации. Для постановки реакции агглютинации из

 диагностической 0-сыворотки готовят ряд разведений (от 1:50 до 1/2 титра сыворотки) в объеме 0,5 мл, к которым добавляют по 0,5 мл взвеси суточной агаровой культуры вибрионов, содержащей

1  Млрд. микробных тел/мл и получают конечные разведения диагности­ческой сыворотки от I/IOO до титра. После инкубирования при 37°С

2  часа и 18 часов при комнатной температуре учитывают результат.
Культуру относят к данному виду, если агглютинация положительна
до 1/2 титра сыворотки.

Следует учитывать  что в некоторых случаях могут быть выде­лены культуры слабо агглютинирующиеся О-сывороткой, тогда реак­цию ставят с OR сывороткой и изучают более полный комплекс свойств.

Принадлежность к серовару определяют с помощью сывороток Огава и Инаба, положительная реакция с одной из них, позволяет отнести выделенную культуру к данному серовару.  Если выделенные штаммы агглютинируются как сывороткой Огава, так и сывороткой Инаба, культуру относят к промежуточному варианту Гикошима.

Для установления биоваров холерных вибрионов - классические вибрионы или Эль-Тор,  определяют чувствительность к диагностичес­ким фагам С и Эль-Тор 2, ставят полимиксиновую пробу,  реакцию агглютинации куриных эритроцитов, реакцию Фогес-Проскауэра (спо­собность при сбраживании глюкозы образовывать ацетилметилкарбинол (ацетоин), который превращается в 2,3-бутанциол) и т.д. Дифференциация биоваров холерных вибрионов