Методические указания по учебно-исследовательской работе студентов (УИРС), страница 7

                                 NH₂                                     N=CH₂ 

                     R-CH       + CH₂О               R-CH              + H₂O

                                COOH                                  COOH

Ход работы

     В первую  коническую колбу вносят 10 мл полученного фильтрата, индикатор с pH перехода около 7 и титруют 0,1 N раствором едкой щелочи до  изменения окраски раствора.

     Во вторую колбу вносят 10 мл дистиллированной воды,  10 мл 40% нейтрализованного раствора формалина с pH перехода около 9 и титруют 0,1N раствором едкой щелочи.

     В третью  колбу  вносят 10 мл полученного фильтрата, 10 мл 40%  нейтрализованного раствора формалина, индикатор с pH перехода около 9 и титруют 0,1N раствором едкой щелочи до изменения окраски раствора.

     Содержание азота формольно-титруемых аминогрупп (ФТА)  в  мг/100  мл  раствора белкового субстрата вычисляют по формуле:

   (А-B-С) x K x C x V₁ x 100

ФТА  =                                                  , где

V х V ₂

А - количество 0,1N раствора едкого натрия пошедшего на титрование колбы №3 , мл;

B - количество 0,1N раствора едкого натрия пошедшего на титрование колбы №2 , мл;

С - количество 0,1N раствора едкого натрия пошедшего на титрование колбы №1 , мл;

К - коэффициент пересчета для 0,1N раствора едкого натрия;

C - количество азота,  эквивалентное 1 мл 0,1N раствора щелочи (1,4 мг азота на  1 мл раствора щелочи);

V₁ - общий объем гидролизата;

V - объем фильтрата, взятый на титрование;

V₂ - объем раствора белкового субстрата, взятый на исследование.

       5.3.2. Методика определения тирозина модифицированным методом Лоури.

    Метод основан на  способности  аминокислоты  тирозин  образовывать  окрашенные комплексы  с  фосфомолибденовой  кислотой (реактив Фолина). Интенсивность окраски комплекса зависит от количества тирозина в исследуемом растворе.

Ход работы

     Для проведения цветной реакции в мерную колбу объемом 50мл внести 1 мл фильтрата, прилить дистиллированной воды (примерно до  половины  объема  колбы),  после этого прилить 1 мл 1N NaOH и 1 мл реактива Фолина.  Содержимое колбы тщательно перемешать,  довести  объем  раствора в колбе до метки дистиллированной водой и вновь тщательно перемешать. Затем колбу выдержать при комнатной температуре в течение 15 минут  для развития окраски,  после чего направить на колориметрирование при длине волны 750 нм (красный сфетофильтр).

    Количество тирозина в исследуемом растворе определяют по калибровочной кривой. При построении калибровочной кривой необходимо приготовить основной раствор  тирозина. Для этого в мерную колбу объемом 50 мл внести 0,1 г  кристаллического  химически чистого тирозина,  добавить дистиллированной воды (примерно до половины объема колбы), содержимое колбы тщательно перемешать и довести объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой. Из полученного основного раствора приготовить ряд разведений и провести с ними цветную реакцию.  С этой целью в 10 мерных колб  объемом 50 мл внести 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 5 мл основного раствора тирозина,  добавить в колбы до половины объема дистиллированной воды, после этого прилить по 1 мл 1 N NaOH и по 1 мл реактива Фолина. Содержимое колб тщательно перемешать,  довести до метки дистиллированной водой и вновь тщательно перемешать.  Затем колбы выдержать при комнатной температуре в течение 15 минут для развития окраски, после чего направить на колориметрирование при длине волны 750 нм (красный  сфетофильтр).  По полученным значениям оптической плотности строят калибровочный график в координатах Df(С_{тирозина}). Технику измерения оптической плотности см. в приложении 3.