Методические указания по учебно-исследовательской работе студентов (УИРС), страница 2

3. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ

    Для проведения  экспериментальной  части  работы используют раствор (или набор растворов), содержащий исследуемый белок.

4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

    Работу выполняют согласно схеме исследования, разработанной студентами и согласованной с преподавателем. Обработку  полученных экспериментальных результатов проводят с помощью прикладных пакетов программ для ПЭВМ.

5. МЕТОДЫ  ИССЛЕДОВАНИЯ

5.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ  БЕЛКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ ЧЕРЕЗ СЕФАДЕКС

     Метод гель-фильтрации  представляет собой разновидность хроматографии,  с помощью которого можно разделить смесь белков и рассортировать  их  по  молекулярным массам.  Для этого раствор, содержащий смесь белков, пропускают через колонку, заполненную мелкими пористыми гранулами  высокогидратированного  полимера-сефадекса.

     Молекулы белков, имеющие сравнительно небольшие размеры, проникают через поры внутрь гранул и их прохождение через колонку замедляется.  Молекулы более  крупных белков  не  могут  проникнуть  внутрь  гранул и проходят через колонку значительно быстрее.  Белки промежуточных размеров будут проходить через колонку с промежуточными  скоростями,  в зависимости от их способности проникать внутрь гранул.  Таким образом колонка,  в которой осуществляется гель-фильтрация, представляет собой молекулярное сито.

    При гель-фильтрации  имеет  большое значение правильный выбор марки сефадекса, т.к.  сефадексы отличаются различной степенью сшивки молекул декстрана друг с другом. Это  приводит  к  различному набуханию гранул сефадекса и ограничению относительной молекулярной массы веществ, способных входить внутрь гранул сефадекса.

      Определяют относительную молекулярную массу белков методом гель-фильтрации с помощью эмперических формул. Установлено, что отношение объема элюента, необходимого для выноса исследуемого белка из колонки (Vэ), и объем элюента, размещающегося в свободном (не занятом гранулами сефадекса) пространстве колонки (Vо), обратно пропорционально величине относительной молекулярной массы белка.

           для сефадекса      G-75     lg Mpr = 5,624 -  0,752Vэ/Vо

           для сефадекса      G-100    lg Mpr = 5,941 -  0,847Vэ/Vо

           для сефадекса      G-200    lg Mpr = 6,698 -  0,987Vэ/Vо

    Свободный объем колонки (Vо) может быть определен двумя способами  -  экспериментально и  с помощью расчета.  При экспериментальном способе свободный объем колонки определяется путем измерения количества вышедшего элюента до появления белка в растворе. При определении свободного объема колонки расчетным способом определяют объем собственно геля (на основании данных приложения,  таблица 7.1) и реальный объем  системы вместе с элюентом.  По разнице значений находят свободный объем колонки. Обычно он составляет 40% от общего объема геля.

    Оборудование и реактивы:

    1) колонка для гельфильтрации;

    2) коллектор фракций или штативы с пробирками;

    3) воронка;

    4) делительная воронка или тубус для элюента;

    5) стаканы стеклянные лабораторные с носиком объемом 200 мл;

    7) трубки каучуковые (диаметр 0,5-0,7 см);

    8) бумажный фильтр;

    9) зажим винтовой;

   10) cтекловата;

   11) cефадекс;

   12) раствор NaCL 1М;

   13) исследуемый белковый раствор;

   14) градуированные пробирки;

   15) штатив;

   16) раствор нингидрина в ацетоне 0,1%-ный;

   17) баня водяная;

   18) зажим для пробирок.

Ход работы

     Подготовка колонки:  резиновую трубку, надетую на выводную трубку колонки, закрепляют зажимом. С помощью стеклянной палочки на дно колонки опускают шарик из стекловаты,  утрамбовывают его палочкой и наливают в колонку cуспензию сефадекса в 1М растворе NaCl на высоту 15-20 см.