Методические указания по учебно-исследовательской работе студентов (УИРС), страница 10

, где

А - количество 0,1N раствора едкого натрия пошедшего на титрование колбы №3 , мл;

B - количество 0,1N раствора едкого натрия, пошедшего на титрование колбы №2 , мл;

С - количество 0,1N раствора едкого натрия, пошедшего на титрование колбы №1 , мл;

К - коэффициент пересчета для 0,1N раствора едкого натрия;

C - количество  азота,  эквивалентное 1 мл 0,1N раствора щелочи (1,4 мг N/1 мл раствора щелочи);

V₁  - объем гидролизата, мл;

V - объем фильтрата, взятый на титрование;

V₂  - объем раствора белка-субстрата, мл.

5.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ pH-ОПТИМУМА ИССЛЕДУЕМОГО ФЕРМЕНТА

     Каталитическую активность фермента можно регулировать, изменяя рН среды. Каждый фермент максимально проявляет свою активность при  определенном  значении  рН, которое называется рН-оптимумом. Отклонение рН среды от рН-оптимума снижает активность фермента.  Это объясняется изменением степени  ионизации  протон-донорных  и протон-акцепторных групп в каталитическом центре фермента.  рН-оптимум фермента не всегда совпадает со значениям рН, характерным для цитоплазмы клеток, в которых находится фермент.

    Определить pH-оптимум действия фермента можно путем сравнения скорости ферментативной реакции в растворах с фиксированными значениями рН.  О скорости ферментативной реакции  можно  судить по количеству тирозина либо по количеству азота формольно-титруемых аминогрупп. Технику определения азота формольно-титруемых аминогрупп по методу Черногорцева и тирозина модифицированным методом Лоури см. п.5.3.1 и п.5.3.2.

    Реактивы и оборудование:

    1) фосфатно-цитратные буферные растворы (приложения, таблица 7.2);

    2) 0,1N раствор NaOH;

    3) кислота трихлоруксусная 5%-ная;

    4) индикатор с рН перехода 7;

    5) индикатор с рН перехода 9;

    6) формалин 40% нейтрализованный;

    7) реактив Фолина;

    8) раствор белка-субстрата;

    9) раствор исследуемого фермента;

   10) фильтры бумажные;

   11) воронки стеклянные;

   12) колбы мерные объемом 200 и 50 мл;

   13) колбы конические объемом 200 мл;

   14) пипетки градуированые объемом 0,1; 1; 10 мл;

   15) бюретка для титрования;

   16) цилиндр мерный объемом 10 мл;

   17) фотоэлектроколориметр;

   18) термостат;

   19) баня водяная.

Ход работы

     Определяют область  рН,  в которой будет производиться исследование активности фермента. В соответствии с таблицей 7.2 приложений выбирают необходимые для исследования буферные растворы.  Количество взятых для проведения ферментолиза конических колб должно соответствовать числу приготовленных буферных смесей.

    Во все приготовленные колбы вносят по 1 мл раствора исследуемого фермента,  по 40 мл буферного раствора с определенными значениями рН.  Содержимое колб тщательно перемешивают. В  каждую колбу вносят по 10 мл раствора белка-субстрата и термостатируют при 45º С в течение 60 минут.  После окончания термостатирования содержимое колб прогревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут для прекращения реакции ферментативного гидролиза.

    Содержимое колб фильтруют через бумажный фильтр и охлаждают. Полученный  фильтрат направляют на определение азота формольно-титруемых аминогрупп по методу Черногорцева или колориметрическое определение  относительного  количества  продуктов гидролиза модифицированным методом Лоури.

     По полученным данным строят график зависимости ФТАf(рН) или С_титрf (рН).

5.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО ОПТИМА ИССЛЕДУЕМОГО ФЕРМЕНТА

     При увеличении температуры скорость ферментативных реакций возрастает так же, как и скорость других химических реакций (с повышением температуры на 10  градусов скорость  реакции увеличивается в 2-4 раза),  однако в отличие от неферментативных процессов такое увеличение скорости ферментативных реакций ограничивается температурой денатурации фермента.  Температура,  при которой наблюдается наибольшая скорость реакции,  называется оптимальной и обозначается t_опт.  Чаще всего t _опт  равна 50-55ºС.  После достижения температуры 55-60˚ С скорость большинства ферментативных реакций начинает падать.