Обнаружение внутриклеточных включений. При размножении вирусов в эпителиальных клетках и фибробластах образуются внутриклеточные включения, располагающиеся в цитоплазме или ядре пораженных клеток. Для выявления включений культуры клеток выращивают на стенках пластинках в пробирках, заражаю вирусом и через определенные сроки инкубации культур, что зависит от свойств инокулированного вируса, готовят препараты, окрашивая их обычными красителями или флюорохромами.
Обнаружение специфического антигена. Для выявления специфического антигена в зараженных клетках препараты готовят так же, как для выявления включений, и обнаруживают по прямому и непрямому методу иммунофлюорисцениции.
При отсутствии цитопатических изменений, внутриклеточных включений, специфического антигена, отрицательных гемадсорбции и гемагглютинации в культурах клеток, зараженных исследуемым методом, проводят два последующих пассажа, по описанной выше методики. При отсутствии указанных изменений в конечном пассаже результат выделения вируса считают отрицательным.
Идентификация вирусов, выделенных в культурах клеток. Для суждения о природе выделенного вируса в качестве ориентировочных критериев могут служить: характер цитопатических изменений в зараженных культурах клеток, морфология и локализация внутриклеточных включений и гемадсорбирующие свойства вируса. Точное установление типовой принадлежности выделенного вируса проводят с помощью серологических реакций. Для типирования вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью, используют реакции торможения гемагглютинации, задержки гемадсорбции, нейтрализации с учетом результатов по гемадсорбции или РСК, а для вирусов, не обладающих этими свойствами, - реакцию нейтрализации цитопатических изменений, цветную пробу или РСК.
Методы гемагглютинации и гемадсорбции.
Реакция гемагглютинации.
В качестве исследуемого материала в реакции гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорион-аллонтоисных оболочек куриных эмбрионов, взвесей и экстракты из культур клеток или органов животных, зараженных вирусами. Перед постановкой реакции испытуемый материал освобождают от крупных частиц центрифугированием при 2000 об в 1 мин в течение 10 мин.
Реакцию гемагглютинации можно ставить двумя методами: 1) капельным на стекле и 2) в развернутом ряду в пробирках или лунках пластин из плексигласа. Первый метод является ориентировочным и применяется для инъекции вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью, второй – используется для титрования этих вирусов.
Для постановки ориентировочной реакции на чистое обезжиренное предметное стекло или в чашку Петри наносят каплю 5 % взвеси эритроцитов, чувствительных к исследуемому вирусу, и каплю испытуемого материала и тщательно смешивают пастеровской пипеткой. При положительном результате через 1-2 мин микроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов.
При постановке реакции агглютинации в развернутом ряду готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25-1 % взвеси трижды отмытых изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитов. Для контроля на спонтанную агглютинацию прибавляют 0,5 мл взвеси эритроцитов в пробирку с 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия, не содержащего вируса. Пробирки энергично встряхивают и оставляют при 37°, 22° или 4°С в зависимости от свойств изучаемого вируса. Результаты реакции учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле, что зависит от видовой принадлежности эритроцитов, процентного содержания их во взвеси и температурного режима реакции. Эритроциты млекопитающих оседают медленнее, чем эритроциты птиц. С увеличением процента эритроцитов во взвеси и повышением температуры окружающей среды оседание эритроцитов ускоряется. Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами: 4 плюса – реакция, имеющая вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик); 3 плюса – реакция с просветами в пленке; 2 плюса – наличие пленки с фестончатыми, кружевными краями из склеившихся эритроцитов; плюс – хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов; минус – резко очерченный осадок эритроцитов, не отличимый от контроля (отсутствие агглютинации). За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на 2 плюса. Это разведение считают содержащим одну гемагглютинирующую единицу вируса (1 АЕ).
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.