Выявление специфической дегенерации клеток. Для выявления морфологических изменений в зараженных культурах клеток их ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа. Многие вирусы при размножении в клетках вызывают их дегенерацию, т.е. оказывают цитопатогенное действие (ЦПД).
Время развития и характер цитопатических изменений в инфицированных культурах клеток определяются свойствами и дозой инокулированного вируса, а также свойствами и условиями культивирования клеток. Одни вирусы проявляют ЦПД в пределах первой недели после заражения (вирусы оспы, полиомиелита, Коксаки В и др.), другие – спустя 1-2 недели после заражения (аденовирусы, парагриппозные вирусы, ЕСНО и др.).
Вирусы вызывают цитопатические изменения трех основных типов: образование многоядерных гигантских клеток и симпластов, являющихся результатом слияния цитоплазмы многих клеток и амитотического деления; круглоклеточную дегенерацию, возникающую вследствие утраты межклеточных связей и округления клеток; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток. Цитопатические изменения первого и третьего типа развиваются в культурах эпителиальных клеток, второго – в культурах фибробластов и эпителия.
Характерные для каждого вируса цитопатические изменения (образование симпластов, очагов клеточной пролиферации и т.д.) развиваются в культурах, зараженных средними дозами вирусов (1000-10000 ЦПД50), при которых процесс гибели пораженных клеток растягивается во времени. При больших и малых дозах вирусов морфологические изменения в культурах бывают нетипичными: большие дозы многих вирусов вызывают быстрое развитие генерализованного некроза с полным отслоением разрушенных клеток от стекла, а малые дозы – медленно развивающуюся очаговую дегенерацию клеток.
Эпителиальные клетки обладают большей чувствительностью к цитопатогенному действию вирусов, чем культуры фибробластов. Это проявляется в более раннем развитии цитопатических изменений и быстром наступлении полной дегенерации.
При развитии цитопатических изменений в культурах клеток их необходимо дифференцировать: 1) от неспецифической «возрастной» дегенерации клеток, наблюдающейся в старых культурах; 2) от дегенерации клеток, обусловленной токсическим действием инокулированного материала; 3) от деструкции клеток, вызванной посторонними контаминирующими вирусами, внесенными с клетками, сывороткой и т. д. Первый и третий типы дегенерации могут быть подтверждены или отвергнуты на основании сравнения зараженных и контрольных незараженных культур клеток. Для исключения токсической природы дегенерации клеток (второй тип) проводят один пассаж. Для этого культуральную жидкость из пробирок с дегенерированными клетками вносят в пробирки со свежими культурами клеток. Если дегенерация была вызвана токсическим фактором испытуемого материала, то деструкция клеток в пассажной культуре не разовьется.
Степень дегенерации клеток, обусловленной выделенным вирусом, оценивают знаками плюс: 4 плюса (++++) – деструкция всех клеток в пробирках, 3 плюса (+++) – деструкция большей части клеток, 2 плюса (++) – деструкция половины клеток, к (+) - меньше половины, плюс-минус (±) – отдельных клеток, минус (-) – отсутствие дегенерации.
При наличии в культурах клеток специфических цитопатических изменений на 2 плюса и более проводят серологическую идентификацию выделенного вируса. Если деструкция клеток выражена слабо и интенсивность ее не усиливается с удлинением времени инкубации, проводят последующие пассажи вируса. С этой целью зараженные культуры подвергают 2-3-кратному замораживанию и оттаиванию для разрушения клеток и извлечения клеток и извлечения внутриклеточного вируса. Культуральную жидкость освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об в 1 мин 5 мин и используют для заражения свежих культур клеток. В процессе пассажей интенсивность обусловленных вирусом цитопатических изменений обычно усиливается и наблюдается более раннее их проявление.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.