При люминесцентной микроскопии препаратов, обработанных по прямому или непрямому методу иммунофлюоресценции, при одних вирусных инфекциях специфический антиген выявляется в цитоплазме в виде ярко светящихся конгломератов различной величины и формы, располагающихся в ранней стадии инфекции клетки вблизи ядра, при других инфекциях антиген обнаруживается в ядре. В поздней стадии инфекции клеток наблюдается свечение всей массы цитоплазмы и ядра. Для доказательства специфичности выявленной флюоресценции проводят два контроля. При прямом методе: 1) обработку специфической флюоресцирующей сыворотки клеток, не зараженных вирусом; 2) обработку специфической флюоресцирующей сывороткой клеток, зараженных вирусом, но предварительно обработанных специфической немаркированной сывороткой. При непрямом методе: 1) обработку не зараженных вирусом клеток специфической немаркированной сывороткой с последующей обработкой их меченой антивидовой сывороткой; 2) обработку зараженных вирусом клеток нормальной сывороткой животного, от которого получена специфическая иммунная сыворотка, с последующей обработкой их меченой антивидовой иммунной сывороткой.
Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации. При выделении вирусов из различных инфекционных материалов в каждом случае применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым слоем клеток. Перед заражением культур клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, соответствующим образом обработанного и проверенного на бактериологическую стерильность. Заражают 4-6 пробирок с культурами клеток и такое же количество культур оставляют незараженными для контроля. После 30-60 мин контакта вируса с клетками при температуре термостата или комнатной в пробирки вносят 1-1,5 мл поддерживающей среды. Взвеси испражнений могут оказывать токсическое действие на клетки (округление и дегенерация через 6-8 часов после заражения и позже). Поэтому посевной материал удаляют перед внесением поддерживающей среды. Для предупреждения быстрого старения и отмирания клеток зараженные культуры поддерживают в менее полноценных питательных средах, чем не зараженные. Для поддержания зараженных культур клеток рекомендуется использовать ту среду, которая применялась для их роста, уменьшив до минимума концентрацию сыворотки или исключить ее полностью. В безбелковых средах первично трипсинизированные культуры клеток лучше сохраняют жизнеспособность, чем перевиваемые клетки, которые обычно требуют наличия некоторого количества сыворотки.
В качестве поддерживающих сред наиболее часто используют следующие. 1. Среда 199 или среда Игла без сыворотки или с 2 % коровьей или лошадиной сыворотки. 2. Раствор Хенкса или Эрла с 0,5 % гидролизата лактальбумина и 2 % коровьей или лошадиной сыворотки. 3. Раствор Хенкса с 5 % гемогидролизата и 2 % коровьей сыворотки. 4. Среда Эндерса: 45 % раствора Хенкса, 50 % коровье амниотической жидкости и 5 % коровьей сыворотки.
Сыворотка, входящая в состав поддерживающих сред, должна быть прогрета до 56°С 30 минут и проверена на отсутствие специфических и неспецифических ингибиторов к предполагаемому вирусу и токсических веществ для клеток. Зараженные культуры инкубируют при 35-37°С. Температура и срок инкубации культур клеток определяются свойствами вируса.
В инфицированных культурах клеток в течение недели питательную среду можно не менять, а оптимальные значение рН (7,2-7,6) поддерживают подщелачиванием растворам NаНСО3.При более длительном культивировании клеток, если проявляются признаки неспецифической дегенерации, производят смену питательной среды.
Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток могут служить: а) развитие специфической дегенерации клеток; б) обнаружение внутриклеточных включений; в) обнаружение специфического антигена методом иммунофлюооресценции; г) положительная гемадсорбция; д ) положительная гемагглютинация.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.