Сыворотка, входящая в состав поддерживающих сред, должна быть прогрета до 56°С 30 мин и проверено на отсутствие специфических и неспецифических ингибиторов к предполагаемому вирусу и токсических веществ для клеток. Зараженные культуры инкубируют при 35-37°С. Температура и срок инкубации культур клеток определяются свойствами вируса.
В инфицированных культурах клеток в течение недели питательную среду можно не менять, а оптимальное значение рН (7,2-7,6) поддерживают подщелачиванием раствором NaHCO3. При более длительном культивировании клеток, если появляются признаки неспецифической дегенерации, производят смену питательной среды.
Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток могут служить: а) развитие специфической дегенерации клеток; б) обнаружение внутриклеточных включений; в) обнаружение специфического антигена методом иммунофлюоресценции; г) положительная гемадсорбция; д) положительная гемагглютинация.
Выявление специфической дегенерации клеток. Для выявления морфологических изменений в зараженных культурах клеток их ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа. Многие вирусы и характер цитопатических изменений в инфицированных культурах клеток определяются свойствами и условиями культивирования клеток. Одни вирусы проявляют ЦПД в пределах первой недели после заражения (вирусы оспы, полиомиелита, Коксаки В и др.), другие – спустя 1-2 нед после заражения (аденовирусы, парагрипозные вирусы, ЕСНО и др.).
Вирусы вызывают цитопатические изменения трех основных типов: образование многоядерных гигантских клеток и симпластов, являющихся результатом слияния цитоплазмы многих клеток и амитотического деления; круглоклеточную дегенерацию, возникающую вследствие утраты межклеточных связей и округления клеток; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток. Цитопатические изменения первого и третьего типа развиваются в культурах эпителиальных клеток, второго – в культурах фибробластов и эпителия.
Характерные для каждого вируса цитопатические изменения (образование симпластов, очагов клеточной пролиферации и т. д.) развиваются в культурах, зараженных средними дозами вирусов (1000 – 10000 ЦПД50), при которых процесс гибели пораженных клеток растягивается во времени. При больших и малых дозах вирусов морфологические изменения в культурах бывают нетипичные: большие дозы многих вирусов вызывают быстрое развитие генерализованного некроза с полным отслоением разрушенных клеток от стекла, а малые дозы – медленно развивающуюся очаговую дегенерацию клеток.
Эпителиальные клетки обладают большей чувствительностью к цитопатогенному действию вирусов, чем культуры фибробластов. Это проявляется в более раннем развитии цитопатических изменений и быстром наступлении полной дегенерации.
При развитии цитопатических изменений в культурах клеток необходимо дифференцировать: 1) от неспецифической «возрастной» дегенерации клеток, наблюдающейся в старых культурах; 2) от дегенерации клеток, обусловленной токсическим действием инокулированного материала; 3) от деструкции клеток, вызванной посторонними контаминирующими вирусами, внесенными с клетками, сывороткой и т. д. Первый и третий типы дегенерации могут быть подтверждены или отвергнуты на основании сравнения зараженных и контрольных незараженных культур клеток. Для исключения токсической природы дегенерации клеток (второй тип) проводят один пассаж. Для этого культуральную жидкость из пробирок с дегенерированными клетками вносят в пробирки со свежими культурами клеток. Если дегенерация была вызвана токсическим фактором испытуемого материала, то деструкция клеток в пассажной культуре не разовьется.
Степень дегенерации клеток, обусловленной выделенным вирусом, оценивают знаками плюс: 4 плюса (++++) – деструкция всех клеток в пробирках, з плюса (+++) – деструкция большей части клеток, 2 плюса (++) – деструкция половины клеток, к (+) – меньше половины, плюс-минус (±) – отдельных клеток, минус (-) – отсутствие дегенерации.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.