Непрямой метод иммунофлюорисценции имеет преимущество перед прямым не только как более чувствительный, но и как более доступный: с помощью одной и той же антивидовой меченой сыворотки можно обнаружить различные вирусные и бактериальные антигены, применяя в каждом случае соответствующую видовую немаркированную специфическую иммунную сыворотку. Например, имея набор немаркированных специфических иммунных сывороток кроликов к различным вирусным и бактериальным антигенам и единую меченую гамма-глобулиновую фракцию сыворотки лошади, иммунизированной нормальной сывороткой кроликов, можно осуществлять лабораторную диагностику вирусных и бактериальных инфекций.
При люминесцентной микроскопии препаратов, обработанных по прямому и непрямому методу иммунофлюорисценции, при одних вирусных инфекциях специфический антиген выявляется в цитоплазме в виде ярко светящихся конгломератов различной величины и формы, располагающихся в ранней стадии инфекции клетки вблизи ядра, при других инфекциях антиген обнаруживается в ядре. В поздней стадии инфекции клеток наблюдается свечение всей массы цитоплазмы и ядра. Для доказательства специфически выявленной флюоресценции проводят два контроля. При прямом методе: 1) обработку специфической флюоресцирующей сывороткой клеток, не зараженных вирусом; 2) обработку специфической флюоресцирующей сывороткой клеток, зараженных вирусом, но предварительно обработанных специфической немаркированной сывороткой. При непрямом методе: 1) обработку не зараженных вирусом клеток специфической немаркированной сывороткой с последующей обработкой их меченой антивидовой сывороткой; 2) обработку зараженных вирусом клеток нормальной сывороткой животного, от которого получена специфическая иммунная сыворотка, с последующей обработкой их меченной антивидовой иммунной сывороткой.
Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым слоем клеток. Перед заражением культур клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, соответствующим образом обработанного и проверенного на бактериологическую стерильность. Заражают 4-6 пробирок с культурами клеток и такое же количество культур оставляют незараженными для контроля. После 30-60 минут контакта вируса с клетками при температуре термостат или комнатной в пробирки вносят 1-1,5 мл поддерживающей среды. Взвеси испражнений могут оказывать токсическое воздействие на клетки (округление и дегенерация ч/з 6-8 часов после заражения и позже). Поэтому посевной материал удаляют перед внесением поддерживающей среды. Для предупреждения быстрого старения и отмирания клеток зараженные культуры поддерживают в менее полноценных питательных средах, чем незараженные. Для поддержания зараженных культур клеток рекомендуется использовать ту среду, которая применялась для их роста, уменьшив до минимума концентрацию сыворотки или исключив ее полностью. В без белковых средах первично трипсинизированные культуры клеток лучше сохраняют жизнеспособность, чем перевиваемые клетки, которые обычно требуют наличие некоторого количества сыворотки.
В качестве поддерживающих сред наиболее часто используют следующие. 1. Среда – 199 или среда Игла без сыворотки или с 2 % коровьей или лошадиной сыворотки. 2. Раствор Хенкса или Эрла с 0,5 % гидролизата лактальбумина и 2 % коровьей или лошадиной сыворотки. 3. Раствор Хенкса с 5 % гемогидролизата и 2 % коровьей сыворотки. 4. Среда Эндерса: 45 % раствора Хенкса, 50 % коровьей амниотической жидкости и 5 % коровьей сыворотки.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.