Микробиология, вирусология, иммунология: Методические указания для самостоятельной работы и к практическим занятиям для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Часть I, страница 3

           Определяет           Растворитель                                                                                                проницаемость,

            устойчивость        веществ                                                                                                        устойчивость  

            к физическим       Дисперсионная                                                                                             Определяют

           факторам                среда          Участвуют в энзиматических                        Составные        токсичность

                                                               процессах                                                         части ферментов,              Источники

                                                               Определяют рН среды,                                    токсинов                            энергии

                                                                окислительно-восстановительный                Определяют                      Определяют

                                                                потенциал                                                         отношение к                      антигенную

                                                                Определяют осмотическое                              красителям,                 специфичность

                                                                 давление                                                                          

Методические указания к практической работе

1. Приготовление мазка из чистой культуры состоит из нескольких последовательных операций: подготовка мазка, высушивание, фиксация и окраска. Исследуемый материал наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Для взятия бактериальной культуры:

- нагревают до покраснения бактериальную петлю в пламени горелки;

- берут пробирку с исследуемой культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцами правой руки к ладони;

- обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут исследуемый материал;

- вынимают петлю, обжигают край пробирки и закрывают пробкой;

- взятый материал осторожно распределяют по предметному стеклу тонким слоем, после чего бактериальную петлю стерилизуют в пламени горелки;

- если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора;

- мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем горелки. Нельзя допускать закипания материала, т.к. при этом может нарушиться структура микроорганизмов;

- фиксация препарата: высушенные мазки подвергают термической (предметное стекло мазком вверх проводят несколько раз через пламя горелки) или химической (фиксирующие растворы: формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары осмиевой кислоты) обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла.

2. Приготовление мазка-смеси: на середину предметного стекла наносят каплю стерильного физиологического раствора, в нее помещают последовательно немного материала первой культуры, а затем после стерилизации петли вносят немного второй культуры. Петлю стерилизуют, охлаждают, петлей смешивают обе культуры в капле воды, распределяют по стеклу, высушивают мазок на воздухе и фиксируют.

3. Существуют простые и сложные методы окраски. При окраске простым методом используется только один краситель – водный фуксин, сафранин (окрашивание производят 1-2 мин), метиленовый синий (окрашивание производят 3-5 мин). После истечения времени окрашивания препарат промывают дистиллированной водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем мазки высушивают на воздухе, при комнатной температуре, или осторожно промокая фильтровальной бумагой. На приготовленный препарат наносят 1 каплю иммерсионного масла и микроскопируют, используя иммерсионный объектив.

4. Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

Окраска мазка по методу Грама. 1) окрасить фиксированный мазок генциан-виолетом (2 мин, через фильтровальную бумагу); 2) бумагу удалить, оставшуюся краску слить; 3) окрасить мазок раствором Люголя (1 мин); 4) раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (на 30-40 секунд осторожно покачивая стеклом); 5) тщательно смыть спирт водой; 6) окрасить водным фуксином (2 мин); 7) промыть водой и высушить при помощи фильтровальной бумаги; 8) микроскопируют с иммерсией.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамположительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного. Способность микроорганизмов окрашиваться в тот или иной цвет зависит от химического состава клеточной стенки. Грамположительные бактерии в клеточной стенке содержат многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами, которые обусловливают прочную связь комплекса генциан фиолетового с йодом и резистентность к обесцвечиванию спиртом. У грамотрицательных такой комплекс не образуется и они чувствительны к обесцвечиванию спиртом.

5. Окраска мазка по методу Нейссера. 1) фиксированный мазок окрашивают уксуснокислым метиловым синим 2-3 мин; 2) наносят раствор Люголя на 20-30 сек; 3) промывают препарат водой; 4) докрашивают водным раствором везувина в течение 1 мин; 5) промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. 

Зерна волютина окрашиваются в темно-синий цвет, тела клеток в светло-коричневый цвет.