Методические указания по учебно-исследовательской работе студентов (УИРС), страница 8

     Пользуясь калибровочной кривой, по оптической плотности исследуемого раствора определяют концентрацию тирозина в фильтрате.

     Количество тирозина в мг/100 мл белкового субстрата вычисляют по формуле:

    Q x V х V₁  х 100

С_{тирозина} =                                   , где

     V₂  х V₃

Q  - количество тирозина по калибровочной кривой;

V  - объем колбы, взятой для проведения цветной реакции, мл;

V₁  - общий объем гидролизата, мл;

V₂ - объем гидролизата, взятого для проведения цветной реакции, 1 мл;

V₃  - объем белкового субстрата, мл.

5.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА

Одним из важнейших свойств ферментов является их субстратная специфичность. Различают три основных вида субстратной специфичности: абсолютную, абсолютно-групповую и относительно-групповую специфичность.

    Абсолютная специфичность  ферментов  подразумевает  их способность катализировать строго определенную реакцию с участием одного строго определенного субстрата. Ферменты, проявляющие групповую специфичность, способны катализировать  реакции с  группой  сходных субстратов.  Под абсолютно-группой специфичностью понимают способность фермента действовать на группу субстратов,  имеющих не только  определенный тип катализируемой связи, но и строго определенную структуру прилегающего к ней радикала (радикалов).  Например, пепсин действует только на пептидные связи, в формировании которых участвуют фенилаланин и тирозин, глутаминовая кислота и лизин или глутаминовая кислота и валин. При относительно групповой специфичности действия фермента изменения химической структуры прилегающих радикалов не имеют значения.

Определить вид специфичности исследуемого протеолитического фермента можно по глубине гидролиза белка. Продукты ферментативного гидролиза белков с участием фермента, обладающего относительно-групповой специфичностью, будут представлены в основном свободными аминокислотами, а абсолютно-групповой специфичностью - олигопептидами и полипептидами.

     Оценить глубину гидролиза белка можно при сравнении значений,  полученных при определении  формольно-титруемого азота по методике Черногорцева и методике Зеренса. Методика определения азота формольно-титруемых аминогрупп по Зеренсу позволяет определить азот аминогрупп свободных аминокислот и коротких (ди-, три-,  тетро-) пептидов. Методика определения азота формольно-титруемых аминогрупп по Черногорцеву  позволяет определить общее количество азота аминогрупп свободных аминокислот и концевых аминокислот пептидов различной молекулярной массы  (коротких  пептидов  и олигопептидов). Различие  методик  определения ФТА состоит в том,  что исследуемые образцы по-разному обрабатываются  перед  взаимодействием с формальдегидом.

    Методика определения  азота  формольно-титруемых  аминогрупп  по  Черногорцеву предполагает прогрев исследуемого образца на кипящей водяной бане, при этом коагулируют только высокомолекулярные фрагменты белка, а олигопептиды, короткие пептиды и свободные аминокислоты остаются в растворе.  Дальнейшие этапы определения позволяют определить количество азота,  принадлежащее NН₂ -группам тех соединений, которые содержатся в фильтрате.

   В методике определения азота формольно-титруемых аминогрупп по Зеренсу в гидролизат приливают ТХУ.  При взаимодействии с этой кислотой коагулируют высокомолекулярные фрагменты белка и олигопептиды.  Таким образом,  в результате более полного осаждения с помощью трихлоруксусной  кислоты,  в  надосадочной  жидкости  остаются только свободные аминокислоты и короткие пептиды.

   Последующие этапы работы по методике Зеренца и Черногорцева идентичны.

    Глубину гидролиза (HD) в % можно рассчитать по формуле: