Методические указания по учебно-исследовательской работе студентов (УИРС), страница 10

, где

А - количество 0,1N раствора едкого натрия пошедшего на титрование колбы №3 , мл;

B - количество 0,1N раствора едкого натрия, пошедшего на титрование колбы №2 , мл;

С - количество 0,1N раствора едкого натрия, пошедшего на титрование колбы №1 , мл;

К - коэффициент пересчета для 0,1N раствора едкого натрия;

C - количество  азота,  эквивалентное 1 мл 0,1N раствора щелочи (1,4 мг N/1 мл раствора щелочи);

V1  - объем гидролизата, мл;

V - объем фильтрата, взятый на титрование;

V2  - объем раствора белка-субстрата, мл.

5.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ pH-ОПТИМУМА ИССЛЕДУЕМОГО ФЕРМЕНТА

     Каталитическую активность фермента можно регулировать, изменяя рН среды. Каждый фермент максимально проявляет свою активность при  определенном  значении  рН, которое называется рН-оптимумом. Отклонение рН среды от рН-оптимума снижает активность фермента.  Это объясняется изменением степени  ионизации  протон-донорных  и протон-акцепторных групп в каталитическом центре фермента.  рН-оптимум фермента не всегда совпадает со значениям рН, характерным для цитоплазмы клеток, в которых находится фермент.

    Определить pH-оптимум действия фермента можно путем сравнения скорости ферментативной реакции в растворах с фиксированными значениями рН.  О скорости ферментативной реакции  можно  судить по количеству тирозина либо по количеству азота формольно-титруемых аминогрупп. Технику определения азота формольно-титруемых аминогрупп по методу Черногорцева и тирозина модифицированным методом Лоури см. п.5.3.1 и п.5.3.2.

    Реактивы и оборудование:

    1) фосфатно-цитратные буферные растворы (приложения, таблица 7.2);

    2) 0,1N раствор NaOH;

    3) кислота трихлоруксусная 5%-ная;

    4) индикатор с рН перехода 7;

    5) индикатор с рН перехода 9;

    6) формалин 40% нейтрализованный;

    7) реактив Фолина;

    8) раствор белка-субстрата;

    9) раствор исследуемого фермента;

   10) фильтры бумажные;

   11) воронки стеклянные;

   12) колбы мерные объемом 200 и 50 мл;

   13) колбы конические объемом 200 мл;

   14) пипетки градуированые объемом 0,1; 1; 10 мл;

   15) бюретка для титрования;

   16) цилиндр мерный объемом 10 мл;

   17) фотоэлектроколориметр;

   18) термостат;

   19) баня водяная.

Ход работы

     Определяют область  рН,  в которой будет производиться исследование активности фермента. В соответствии с таблицей 7.2 приложений выбирают необходимые для исследования буферные растворы.  Количество взятых для проведения ферментолиза конических колб должно соответствовать числу приготовленных буферных смесей.

    Во все приготовленные колбы вносят по 1 мл раствора исследуемого фермента,  по 40 мл буферного раствора с определенными значениями рН.  Содержимое колб тщательно перемешивают. В  каждую колбу вносят по 10 мл раствора белка-субстрата и термостатируют при 45º С в течение 60 минут.  После окончания термостатирования содержимое колб прогревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут для прекращения реакции ферментативного гидролиза.

    Содержимое колб фильтруют через бумажный фильтр и охлаждают. Полученный  фильтрат направляют на определение азота формольно-титруемых аминогрупп по методу Черногорцева или колориметрическое определение  относительного  количества  продуктов гидролиза модифицированным методом Лоури.

     По полученным данным строят график зависимости ФТАf(рН) или Ститрf (рН).

5.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО ОПТИМА ИССЛЕДУЕМОГО ФЕРМЕНТА

     При увеличении температуры скорость ферментативных реакций возрастает так же, как и скорость других химических реакций (с повышением температуры на 10  градусов скорость  реакции увеличивается в 2-4 раза),  однако в отличие от неферментативных процессов такое увеличение скорости ферментативных реакций ограничивается температурой денатурации фермента.  Температура,  при которой наблюдается наибольшая скорость реакции,  называется оптимальной и обозначается tопт.  Чаще всего t опт  равна 50-55ºС.  После достижения температуры 55-60˚ С скорость большинства ферментативных реакций начинает падать.