Методические указания по учебно-исследовательской работе студентов (УИРС), страница 12

     После окончания термостатирования колбы прогревают на кипящей водяной бане 10 минут для прекращения реакции ферментативного гидролиза. Содержимое колб фильтруют через бумажный фильтр и охлаждают до комнатной температуры.  После этого полученный фильтрат направляют на определение азота формольно-титруемых аминогрупп по  методу Черногорцева или калориметрическое определение относительного количества продуктов гидролиза модифицированным методом Лоури.

      Получив зависимость  Vf([S])  для процесса ферментативного гидролиза,  строят график зависимости в координатах Лайнуивера-Бэрка (1/Vf(1/[S])). необратимое и обратимое конкурентное и неконкурентное ингибирование.

                                                         Таблица 1

Номер колбы	Вносимое количество дистиллирован-ной воды, мл	Вносимое количест-во раствора белка, мл	Номер колбы	Вносимое количество дистилли-рованой воды, мл	Вноси-мое кол-во раствора белка, мл
1	0	50	4	30	20
2	10	40	5	40	10
3	20	30	6	45	5

5.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ ИНГИБИРОВАНИЯ

ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ В ЗАВИСИМОСТИ

ОТ ДОЗЫ ВВЕДЕННОГО ИНГИБИТОРА

     Ингибиторами называются молекулы,  которые замедляют скорость  ферментативной реакции. Ингибиторы бывают обратимыми и необратимыми.  Необратимый ингибитор модифицирует молекулы фермента в результате чего они  частично  или  полностью  теряют свою активность. Обратимые ингибиторы не вызывают изменений молекул фермента и при диссоциации комплекса фермент-ингибитор фермент не теряет своей активности.  По механизму действия обратимое ингибирование делится на конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное.

     При конкурентном ингибировании ингибитор настолько похож на молекулу субстрата, что фермент не может различить их. В результате связывания конкурентного ингибитора  с  активным  центром фермента падает концентрация ES-комплексов и скорость реакции снижается.

     Неконкурентный ингибитор связывается не с активным центром, а с другим участком фермента. Связывание с неконкурентным ингибитором не мешает ферменту образовывать ES-комплексы.  Такой  ингибитор  не понижает концентрацию фермент-субстратных комплексов, а влияет на скорость превращения S в P.

Бесконкурентный ингибитор  связывается только с фермент-субстратными комплексами и не связывается со свободным ферментом.

    Оборудование и реактивы:

   1) 0,1N раствор NaOH;

   2) индикатор с рН перехода 7;

   3) индикатор с рН перехода 9;

   4) формалин 40% нейтрализованный;

   5) реактив Фолина;

   6) раствор белка-субстрата;

   7) раствор исследуемого фермента;

   8) фильтры бумажные;