Оставляют колонку для отстаивания и после того, как образуется осадок сефадекса высотой 2 см, открывают зажим и дают жидкости вытекать в находящуюся под колонкой емкость.
В колонку приливают суспензию сефадекса до тех пор, пока высота слоя сефадекса не составит примерно 15 см. После этого через колонку пропускают в течение 10-20 часов 0,85 %-ный (1М) раствор хлористого натрия для промывания геля и формирования его верхней границы, при этом гранулы геля должны быть полностью погружены в раствор хлористого натрия. На поверхность геля укладывают заранее приготовленный диск из фильтровальной бумаги. Диаметр диска должен соответствовать по размеру внутреннему диаметру колонки. Закрывают зажимом резиновую трубку и переходят к следующему этапу работы.
Внесение исследуемого материала: Содержание белка в растворе, подлежащем гель-фильтрации должно быть не менее 10 мг/мл. У колонки с сефадексом слегка ослабляют зажим на резиновой трубке и устанавливают объем элюирующего раствора на одном уровне с поверхностью геля. Осторожно, стараясь не повредить поверхность геля, наносят на поверхность бумажного диска 4 мл исследуемого белкового раствора. Затем ослабляют зажим в нижней части колонки и собирают элюат по 1 мл в предварительно подготовленные градуированные пробирки. После того, как уровень жидкости сравняется с поверхностью геля закрывают зажим колонки. При помощи пипетки осторожно наносят по стенке колонки 3-4 мл 1М раствора NaCl, после чего подключают к колонке склянку с этим раствором. Ослабляют зажим на резиновой трубке колонки и продолжают элюцию. Собирают элюат по 1 мл при помощи коллектора фракций, либо в градуированные пробирки со штативом. Элюцию ведут со скоростью 1 мл/мин. Это регулируется изменением высоты склянки с элюирующим раствором относительно колонки.
Определение наличия белка во фракциях элюента
(биуретовая реакция).
В пробирки, содержащие фракции элюента, добавить по 10 капель 30%-ного раствора едкого натра и по 2-3 капли 1% раствора сульфата меди. Пробирки с элюентом, содержащим белок, приобретут сине-фиолетовое (или красно-фиолетовое) окрашивание.
Сине-фиолетовое окрашивание, появляющееся в щелочной среде в присутствие солей меди, обусловлено присутствием в растворе белка и продуктов его неполного гидролиза – пептонов и полипептидов, так как пептидные связи в щелочной среде образуют с сернокислой медью окрашенные комплексы по уравнению:
…
NH CH CO NH CH CO NH …
|
|
|
||||||||||
|
|
|||||||||||
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.