Методические указания по учебно-исследовательской работе студентов (УИРС), страница 6

    2) пробирки химические;

    3) капельницы химические;

    4) реактив Фоля;

    5) зажим для пробирок;

    6) раствор едкого натра 33%-ный.

Ход работы

     В пробирку наливают 5 капель раствора белка и  добавляют  5  капель  33%-ного раствора  NaOH,  3  капли  5%-ного  раствора уксуснокислого свинца (реактив Фоля). Смесь тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане.  Через 3-5 минут  выпадает черный или бурый осадок сульфида свинца.  Если белок содержит незначительные количества серусодержащих аминокислот, в пробирке черного осадка не образуется.

5.2.6. Реакция Сакагучи (реакция на аргинин)

     Белки в присутствии щелочи дают красное окрашивание с гипобромидом и  α-нафтолом.  Реакция обусловлена наличием в белке аминокислоты аргинина,  имеющей в своем составе гуанидиновую группировку, которая окисляется гипобромидом и окисленный аргинин, соединяясь с  α -нафтолом, образует продукт конденсации красного цвета.

     Оборудование и реактивы:

     1) раствор исследуемого белка;

     2) пробирки химические;

     3) капельницы химические;

     4) спиртовой раствор  α -нафтола 0,1%-ный;

     5) зажим для пробирок;

     7) раствор едкого натра 10%-ный;

     8) раствор гипобромида натрия 2%-ный;

     9) раствор мочевины 40%-ный.

Ход работы

     В пробирку вносят 5 капель раствора белка, 5 капель 10% раствора NaOH, 3 капли 0,1 %  спиртового раствора  α -нафтола и по каплям (всего 1-5 капель) 2%-ного раствора  гипобромида натрия. Жидкость в пробирке становится красного цвета.  Для стабилизации быстро развивающегося красного окрашивания  немедленно  вливают  1  мл раствора мочевины.

5.3. ИССЛЕДОВАНИЯ СТЕПЕНИ РАСЩЕПЛЕНИЯ БЕЛКА

(сравнение степени переваривания)

     Денатурация белков оказывает значительное влияние на степень  их  расщепления протеолитическими ферментами.  При денатурации пептидные связи перемещаются на поверхность, либо в центральную область белковой молекулы. При этом изменяется их переваримость.

     Оборудование и реактивы:

     1) раствор исследуемого белка;

     2) пипетки градуированные объемом 10 мл;

     3) раствор фермента;

     4) термостат;

     5) 0,1N раствор NaOH;

     6) индикатор с pH перехода около 7;

     7) индикатор с pH перехода около 9;

     8) колбы конические объемом 200 мл;

     9) воронки стеклянные;

    10) фильтры бумажные;

    11) бюретка для титрования;

    12) раствор формальдегида, 40% нейтрализованный;

    13) цилиндр мерный объемом 10 мл.

Ход работы

     В две колбы вносят по 50 мл белкового раствора.  Затем белок в одной из  колб денатурируют,  подвергая  его  тепловому  воздействию.  В обе колбы вносят по 5 мл раствора фермента и направляют на термостатирование при 45 - 50 ⁰С в течение  60  минут. После  окончания термостатирования колбы прогревают на кипящей водяной бане 10 минут для инактивации фермента. Содержимое колб фильтруют через бумажный фильтр и охлаждают до комнатной температуры. После этого полученный фильтрат направляют на определение азота формольно-титруемых аминогрупп по методу Черногорцева или  колориметрическое  определение относительного количества продуктов гидролиза модифицированным методом Лоури.

5.3.1. Методика определения азота формольно-титруемых аминогрупп по  Черногорцеву

    Метод определения  азота  формольно-титруемых  аминогрупп позволяет определить количество азота в аминогруппах,  принадлежащих продуктам гидролитического расщепления белков (аминокислоты, олигопептиды, короткие пептиды, полипептиды).

    Определение азота формольно-титруемых аминогрупп основано на способности  формалина вступать во взаимодействие со свободными аминогруппами продуктов гидролитического расщепления белков. При этом образуются сильные метиленаминокислоты: