Температурный оптимум действия фермента может быть установлен путем сравнения скорости ферментативной реакции в растворах с фиксированными значениями температуры. О скорости ферментативной реакции можно судить по количеству тирозина либо по количеству азота формольно-титруемых аминогрупп. Технику определения азота формольно-титруемых аминогрупп по методу Черногорцева и тирозина модифицированным методом Лоури см. п.5.3.1 и п.5.3.2.
Реактивы и оборудование:
1) 0,1N раствор NaOH;
2) индикатор с рН перехода 7;
3) индикатор с рН перехода 9;
4) формалин 40% нейтрализованный;
5) реактив Фолина;
6) раствор белка-субстрата;
7) раствор исследуемого фермента;
8) фильтры бумажные;
9) воронки стеклянные;
10) колбы мерные объемом 50 мл;
11) колбы конические объемом 200 мл;
12) пипетки градуированные объемом 1 и 10 мл;
13) бюретка для титрования;
14) цилиндр мерный объемом 10 мл;
15) фотоэлектроколориметр;
16) термостаты, с заранее установленной температурой;
17) баня водяная.
Ход работы
В 4 колбы внести по 5 мл раствора фермента, по 50 мл раствора белка-субстрата и направить на термостатирование при 25, 35, 45, 65 ºС в течение 60 минут.
После окончания термостатирования содержимое колб прогревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут для прекращения реакции ферментативного гидролиза. Содержимое колб фильтруют через бумажный фильтр и охлаждают. Полученный фильтрат направляют на определение азота формольно-титруемых аминогрупп по методу Черногорцева или калориметрическое определение относительного количества продуктов гидролиза модифицированным методом Лоури.
По полученным данным строят график зависимости ФТАf(Т) или Ститр f (Т).
5.7. ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Характерная форма кривой насыщения фермента субстратом может быть выражена математически уравнением Михаэлиса-Ментен. Это уравнение было выведено Михаэлисом и Ментен исходя из основного предположения о том, что стадией, лимитирующей скорость ферментативных реакций, является распад комплекса ЕS на продукт и свободный фермент. Это уравнение составляет основу для анализа кинетики всех ферментативных реакций. Если известны величины Кm и Vmax, то можно рассчитать скорость ферментативной реакции при любой заданной концентрации субстрата. Теория Михаэлиса-Ментен позволяет количественно описать большинство ферментативных реакций, включая реакции с участием двух и более субстратов.
Для того, чтобы установить подчиняется ли процесс гидролиза, катализируемый исследуемым ферментом, кинетической модели Михаэлиса-Ментона необходимо установить зависит ли скорость реакции (V) от концентрации белкового субстрата ([S]) (при неизменной концентрации фермента!). Гиперболический характер полученной зависимости Vf ([S]) доказывает адекватность процесса модели.
Оборудование и реактивы:
1) 0,1N раствор NaOH;
2) индикатор с рН перехода 7;
3) индикатор с рН перехода 9;
4) формалин 40% нейтрализованный;
5) реактив Фолина;
6) раствор белка-субстрата;
7) раствор исследуемого фермента;
8) фильтры бумажные;
9) воронки стеклянные;
10) колбы мерные объемом 50 мл;
11) колбы конические объемом 200 мл;
12) пипетки градуированные объемом 1 и 10 мл;
13) бюретка для титрования;
14) цилиндр мерный объемом 10 мл;
15) фотоэлектроколориметр;
16) термостат;
17) баня водяная.
Ход работы
Для получения различной концентрации белкового субстрата, в 6 колб объемом по 200 мл вносят раствор белка-субстрата, и дистиллированную воду в количествах, указанных в таблице 1. В колбы с различной концентрацией субстрата вносят по 1 мл раствора фермента. Затем все колбы направляют на термостатирование при 45ºС в течение 60 минут.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.