В чашке Петри смешиваем 2,4 миллилитра Среды Игла и 600 микролитров 0,005% раствора продигиозана. При этом каждые 100 микролитров полученного раствора содержат один микрограмм продигиозана. Раствор используется для индукции продукции интерлейкина -1 и фактора некроза опухоли.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРА ГЕПАРИНА
В пробирке смешиваем 4,2 миллилитра Среды Игла и 0,8 миллилитра раствора гепарина. Раствор стерильно разливаем по 0,5 миллилитра в пробирки для забора крови. Таким образом каждая пробирка содержит 400 ед. гепарина, что позволяет предотвратить свертывание десяти миллилитров крови.
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ КРОВИ
Гепаринизированную кровь тщательно перемешиваем. Смешиваем 0,6 миллилитра крови и 2,4 миллилитра среды Игла, таким образом мы разводим кровь в пять раз.
При исследовании образцов крови от больных с лимфопролиферативными заболеваниями лучше использовать взвесь лимфоцитов, выделенных на градиенте плотности фиколл-верографин (1.077) в среде RPMI-1640/ Концентрацию лимфоцитов довести до 1х106/мл
ПОСТАНОВКА ТЕСТА
В 96 - луночный планшет для культивирования клеток вносим в первые три лунки каждого ряда по 100 микролитров рабочего pacтвopa фитогемаглютинина, в следующие три лунки вносим по 100 микролитров рабочего раствора продигиозана, в оставшиеся шесть лунок каждого ряда вносим по 100 микролитров среды Игла. Подготовленные образцы периферической крови вновь тщательно перемешиваем, по 100 микролитров разведенной крови вносим во все лунки ряда. Каждый образец крови вносим в отдельный ряд. Культуральные платы помещаем в CO2- инкубатор на 24 часа. По окончании культивирования осторожно собираем супернатанты со всех лунок планшета. Супернатанты культур крови, стимулированных фитогемаглютинином используются для определения интерлейкина-2 и интерлейкина-6. Супернатанты культур крови стимулированных продигиозаном используются для определения уровня продукции интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли.
До использования супернатанты могут храниться в замороженном состоянии при температуре –20оС в течение месяца без потери своей активности.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ И СУПЕРНАТАНТАХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
Определение цитокинов (ИЛ-1b, ИФН-a, ФНО-a) методом
твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Определение цитокинов в сыворотке крови можно проводить методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием специальных тест-систем. В нашей практике мы используем тест-системы, разработанные в НИИ особо чистых биопрепаратов и производимые фирмой “Протеиновый контур”(Санкт-Петербург). В них используется “сэндвич”-метод ИФА. На первом этапе в лунках 96-луночной платы для ИФА сорбируют моноклональные антитела к исследуемому цитокину. Затем в лунки вносят исследуемые образцы сывороток или супернатантов, а также несколько стандартных контрольных образцов цитокина с известной концентрацией. В качестве вторых антител используется хроматографически очищенная на антигене поликлональная кроличья сыворотка (для выявления ФНО- a и ИЛ-1b) или моноклональные биотинилированные антитела к другому эпитопу исследуемого цитокина (a-ИФН).. В качестве третьего компонента “сэндвича” используются козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (при определении ФНО-a) или конъюгат стрептавидина с полимеризованной пероксидазой (при определении ИЛ-1b и a-ИФН). Для определения концентрации каждого из цитокинов исследуют специфическую ферментативную активность, которую оценивают по изменению окраски хромогена. Результаты реакции оцениваются спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Минимальная концентрация цитокина, определяемая с помощью тест-систем составляет 20 пг/мл при определении ФНО- a и ИЛ-1b с, и 10 пг/мл при определении a -ИФН. Для вычисления концентрации цитокинов в исследуемых образцах строится график зависимости оптической плотности от концентрации по характеристикам стандартных образцов с известной концентрацией цитокина. По выстроенным графикам (или вычисленных формулам зависимости) определяется концентрация цитокинов в исследуемых образцах сывороток или супернатантов.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.