2) Подготовка проб индуцированных ИФН-a и ИФН-g к анализу.
После образования полного монослоя, в микропланшеты вносили содержащие интерферон пробы. Непосредственно перед анализом пробы, содержащие индуцированный ИФН-g, центрифугировали при 1500 g в течение 10-15 минут для осаждения клеточных элементов; пробы, содержащие индуцированный ИФН-a, центрифугировали при 3000-4000 g в течение 20-30 минут для осаждения выпавших в осадок белков и клеточных элементов.
В лунки микропланшета 8-канальной микропипеткой (“Labsystems”) вносили по 100 мкл поддерживающей питательной среды (ПС), являющейся полным аналогом РС, но содержащей только 2% сыворотки КРС вместо 10%. После этого в лунки ряда “А” последовательно вносили анализируемые пробы в количестве 100 мкл и раститровывали по лункам рядов “В”-“Н” соответствующих столбцов перенесением в каждую последующую лунку 100 мкл пробы, так что коэффициент разведения от лунки к лунке был равен 2. Таким образом, в каждой лунке вспомогательного микропланшета содержалось по 100 мкл пробы необходимого разведения.
Пробы в микропланшетах располагали следующим образом:
· Столбцы 1 и 2 рядов “А” ¾ “G”: референс препарат ИФН с рядом вертикального падения концентрации: 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78 МЕ/мл.
· Столбцы 1 и 2 ряда “Н”: не содержащие ИФН контрольные пробы (ПС) для контроля протекания процесса развития цитопатического действия (ЦПД) индикаторного вируса.
· Столбцы 3 ¾ 12 рядов “А” ¾ “Н”: раститрованные в 4-х или 8-ми лунках анализируемые пробы.
Затем опытные микропланшеты, содержащие клеточный монослой с нанесенными анализируемыми пробами помещали в СО2-термостат при 37°С на 24 часа.
Инкубация клеток с индикаторным вирусом. После 24 часов инкубации из микропланшетов удаляли ПС с раститрованными пробами и в каждую лунку вносили по 100 мкл ПС, содержащей 100 цитопатических доз (ЦПД) индикаторного вируса везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана.
После внесения ВВС в опытные микропланшеты, последние помещались в СО2-термостат при 37°С на 18-24 часа. Остановка инкубации производилась при достижении 100% деструкции монослоя клеток в лунках с контролем ВВС и при значительной деструкции монослоя в лунках, содержавших наибольшие разведения референса ИФН и исследуемых проб (оптимальным считается момент остановки инкубации в то время, когда достигнута 90-100%-я деструкция монослоя в лунках, содержащих 0,78 МЕ/мл референса ИФН и, соответственно, 20-30 % деструкция монослоя в лунках, содержащих 1,56 МЕ/мл референса ИФН). При соблюдении этих условий достигается максимальная чувствительность методики, позволяющая определять содержание ИФН в пробах с точностью до ±1,0 МЕ/мл.
4) Учет результатов анализа.
После остановки инкубации клеточного монослоя с ВВС из планшетов удалялась жидкость, содержащая вирус, и в каждую лунку 8-канальной микропипеткой вносили 50 мкл раствора красителя кристаллического фиолетового (0,5% раствор на 30% этаноле). Окрашивание производили в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого из микропланшетов удаляли раствор красителя и микропланшеты промывали в проточной водопроводной воде комнатной температуры 5-10 кратным погружением. Затем микропланшеты высушивали на воздухе.
Учет результатов производили посредством определения абсорбированного клетками монослоя красителя. В каждую лунку микропланшета добавляли 100 мкл 30 % этанола и красителя при 37°С с последующим сканированием микропланшетов на ридере для ИФА фирмы «Beckman». Измерения производили при длине волны 540 нм. После получения значений величин оптической плотности экстракта строили калибровочную кривую зависимости степени деструкции клеточного монослоя от концентрации интерферона, используя данные по референсу ИФН (ГИСК им. Тарасевича). Затем по полученной калибровочной кривой определяли содержание ИФН в анализируемых пробах, выраженное в международных единицах (МЕ) на мл. При этом учитывали все коэффициенты разведения для каждого исследуемого образца.
Таким образом изучение параметров ИФН-статуса проводили с помощью твердофазного ИФА (сывороточный ИФН-a и его спонтанная продукция МНПК) и культуральных исследований (общий ИФН, стимулированная продукция ИФН-a и ИФН-g)
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.