При отсутствии тест систем для определения ИЛ-6 с помощью ИФА определение этого цитокина можно проводить с помощью стандартного теста поддержания пролиферации ИЛ-6-зависимой гибридомной мышиной линии В9 (ВНИИОЧБ, Санкт-Петербург) (Aarden L.A., De Groot E.R., Schaap O.L., Zansdorp P.M. Production of hibridoma growth factor by human monocytes // Eur. J. Immunol - 1987. - Vol.17, No 11. - P.1411-1416). Этот тест является наиболее чувствительным и специфичным для измерения активности ИЛ-6. Одна единица активности, определяемая этим тестом, соответствует примерно 1 пг нативного ИЛ-6. Единицы биологической активности ИЛ-6 рассчитывали путем сравнения значения со стандартными препаратами ИЛ-6 (“Sigma”). Минимальная определяемая концентрация для ИЛ-6 составила 1 пг/мл.
Определение показателей интерферонового статуса
Оценка ИФН-статуса включала определение:
1. содержания общей фракции сывороточного ИФН в сыворотке периферической крови (ИФН- общ.).
2. уровня стимулированной продукции ИФН-a лейкоцитами периферической крови при индукции вирусными индукторами (ИФН-a стим.).
3. уровня стимулированной продукции ИФН-g при индукции митогенами in vitro (ИФН-g стим.).
Основные принципы используемой методики заключаются в том, что ИФН обладает антивирусной активностью, проявляющейся в торможении репродукции вируса и, следовательно, в ингибировании его цитопатического действия (ЦПД), проявляющегося в деструкции монослоя клеток после их инкубации с вирусом. Торможение развития ЦПД можно охарактеризовать количественно, окрашивая клеточный монослой после инкубации с ИФН-содержащими пробами и индикаторным вирусом. Количество абсорбированного клетками красителя обратно пропорционально степени развития ЦПД и прямо пропорционально содержанию ИФН в исследуемых пробах.
Основные стадии анализа: 1) получение монослойной клеточной культуры; 2) преинкубация клеточного монослоя с ИФН-содержащими пробами; 3) инкубация клеточного монослоя с раствором индикаторного вируса; 4) учет результатов анализа (окраска лунок с клетками и определение степени деструкции монослоя).
Забор крови
В стерильные пробирки с гепарином, концентрация которого составила 15-20 ед/мл, забиралась венозная кровь пациентов объемом от 0,5 мл до 2 мл. В последующем кровь хранилась не более 5-6 часов в холодильнике при температуре +4°С.
Подготовка анализируемых проб
1) В стерильные эппендорфы фирмы ”Elkay” вносилась среда RPMI-1640 (“Serva”) с добавлением глутамина, антибиотиков (пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл, OAO “Феррейн”), 2% сыворотки крупного рогатого скота (КРС- производства ИЧП “Биолот”); растворы индукторов интерферона (вирус NDV для ИФН-a, полученный в лаборатории химиотерапии НИИ гриппа РАМН, и стафилококковый энтеротоксин - СЭА для ИФН-g, фирмы “Sigma”) и цельная кровь в соотношении 8/1/1 (200 мкл RPMI-1640, 25 мкл раствора индуктора, 25 мкл цельной крови). Полученная индукционная смесь инкубировалась при 37°С в течение 24 часов. Затем в эппендорфы, в которых производилась индукция ИФН-a, добавлялся 0,1 н. раствор HCl до рН 2.0 и проба инкубировалась в течение 1 часа при 37°С, после чего в нее вносили 0.1 н. раствор NaOH до рН 7.4. Обработанные таким образом пробы с индуцированным ИФН-a и ИФН-g замораживалась для хранения при -25°С.
2) Цельная кровь центрифугировалась (на лабораторной центрифуге фирмы ”Beckman”) при 1000 g, после чего в стерильный эппендорф отбирали 50 — 200 мкл сыворотки для анализа содержания общего сывороточного интерферона. Отобранная сыворотка замораживалась для хранения при -25°С.
Постановка анализа
1) Получение монослоя клеток.
В стерильные микропланшеты (производитель - ”Costar”) для культур клеток, предварительно обработанные УФО в течение 1,5 - 2 часов, вносилась суспензия клеток L-41 (клоновый вариант тканевой культуры L-96, полученной из костного мозга больного лейкозом в лаборатории культур клеток НИИ гриппа РАМН) в ростовой питательной среде (РС) концентрацией » 500 000 клеток/мл из расчета 100 мкл суспензии в лунку. Ростовая среда представляет собой среду Игла фирмы ”Serva”, содержащую 10% сыворотки КРС, глутамин (300 мг/л), антибиотики (пенициллин, стрептомицин по 100 ед/мл). Засеянные микропланшеты помещались в СО2-термостат при 37°С до образования полного монослоя клеток (при соблюдении указанных условий монослой образуется через 24 часа).
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.