Y. Lin и коллектив авторов показали, что вероятность bcl-2 транслокации часто растет с возрастом у человека. Они исследовали лимфоциты периферической крови 53 доноров без лимфоидной неоплазии и ткани 31 аутопсий с использованием ПЦР. Транслокация была обнаружена в 55% образцов периферической крови и 35% аутопсийных образцов селезенки с частотой 1-853 транслокаций на миллион клеток. Частота транслокаций значительно увеличивалась с возрастом в периферической крови и селезенке, также как и возрастает риск возникновения лимфомы. Среднее число частоты транслокаций было более чем в 40 раз больше в селезенке и в 13 раз больше в периферической крови у самых старших доноров (61 год и старше), по сравнению с самыми молодыми (20 лет или моложе). Особенные t(14;18)-несущие клоны находили в течение периода свыше 5 месяцев у 2-х доноров. Эти находки демонстрируют, что клоны, несущие онкогенную транслокацию, присутствуют и у нормальных людей, что такие клоны являются долгоживущими, и что частота их возникновения растет в возрастом (рис.6) /27/.
G/Dolken и соавторы также попытались ответить на вопрос, обнаруживаются ли с помощью ПЦР t(14;18)-положительные клетки в периферической крови здоровых доноров и крови пациентов с незлокачественными заболеваниями. Они обследовали 36 здоровых доноров и 21 пациента с незлокачественными заболеваниями. Авторам удалось обнаружить t(14;18)-положительные клетки в 50% здоровых доноров и пациентов с незлокачественными заболеваниями. Сравнив с 17 t(14;18)-положительными пациентами, бывшими в полной ремиссии после радиотерапии при лимфоме низкой степени злокачественности, большинство из 26 здоровых доноров имели зн6ачительно ниже число t(14;18)-позитивных клеток, циркулирующих в периферической крови. В случае 6 здоровых доноров более чем 1 t(14;18)-ДНК фрагмент был обнаружен. У одного здорового донора 4 различных t(14;18)-положительных клеточных клона были обнаружены в 9 образцах, полученных за 5 лет. Таким образом, появление t(14;18) транслокации не ограничивается клетками фолликулярной лимфомы. У здоровых доноров долгоживущие t(14;18)-положительные клетки могут быть обнаружены с помощью ПЦР, если чувствительность достаточно высока. Основываясь на анализе нуклеотидной последовательности, t(14;18)-ДНК фрагменты, обнаруженные у здоровых доноров, не отличаются от таковых, найденных в фолликулярных лимфомах. Кроме того, обнаружение t(14;18)-положительных В-клеточных клонов у здоровых доноров показывает, что важно определять эту трансформацию в первичных клетках лимфомы для сравнения с клоном, найденным при полной ремиссии. Вообще, число циркулирующих t(14;18)-положительных клеток у здоровых доноров является низким, и с несколькими исключениями, слишком низким по сравнению с таковым у пациентов с фолликулярной лимфомой при использовании стандартной ПЦР /30/.
Обнаружение хромосомных траснслокаций с помощью ПЦР. Исследование этиологии, патогенеза и прогноза человеческих заболеваний обычно ассоциируется с различными биохимическими и иммуногистохимическими методиками. В последнее время широко использовались и молекулярно-биологические методы, предметом исследования которых является генетический материал клеток (ДНК и РНК). Наиболее новым и удобным методом молекулярной биологии является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая дает широкие возможности для диагностических и прогностических целей. ПЦР - это метод, который вследствие своей высокой чувствительности и скорости во многих случаях заменил предшествующие молекулярно-биологические методы, такие как Саузерн-блоттинг и гибридизацию in situ в биомедицинских исследованиях. Суть метода ПЦР заключается в амплификации специфических сегментов ДНК /49/. Многие заболевания, включая лимфомы и лейкозы, связаны с транслокацией одной полной хромосомы или ее фрагмента на другую хромосому. Хромосомные транслокации вызывают патологии ряда заболеваний, так как точка разрыва в гене изменяет его экспрессию и может привести к активации онкогенной экспрессии. Это и происходит в случае t(14;18), вовлекающей протоонкоген bcl-2. По крайней мере половина этих транслокаций случаются в пределах участка длиной 150 пар оснований, который и амплифицируется с помощью ПЦР /50, 51/. Накопление ПЦР-продукта показывает, что транслокация произошла, и предоставляет еще один аргумент в пользу диагноза фолликулярной лимфомы. В отсутствие ПЦР-амплификации такой диагноз не может быть исключен, так как могли произойти альтернативные транслокации. Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаружить одну из десяти тысяч клеток, допуская постановку диагноза при условиях, которые делают сложным или невозможным применение морфологических или цитогенетических анализов. Обнаружение хромосомной транслокации методом ПЦР особенно полезно в мониторировании ремиссий и рецидивов у пациентов с лимфомами, что также применимо для ретроспективного анализа архивного материала /51/. Предполагается, что ПЦР станет рутинным методом в диагностических лабораториях, где она будет давть дополнительную информацию при обычных обследованиях пациентов.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.