Медицина \ Микробиология, вирусология и иммунология

Микробиология, вирусология, иммунология: Методические указания для самостоятельной работы и к практическим занятиям для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Часть III, страница 9

Цель занятия: Изучить сущность и методы постановки peакции преципитации, диагностические возможности, оценку, информативность

План занятия

1. Реакция преципитации, характеристика компонентов

2. Механизм реакции преципитации. Методы постановки

3. Практическое использование реакции преципитации

Методические указания к демонстрации

Реакция преципитации в геле

Реакция преципитации в геле использована для определения токсигенности у дифтерийных бактерий. Для этого в чашку Петри на поверхность питательной среды помещена полоска фильтровальной бумаги, пропитанная антитоксической противодифтерийной сывороткой. На расстоянии 0,6-0,8 см от края бумажки засеяны в виде бляшек с каждой стороны по 2-3 испытуемые культуры и заведомо токсигенные (для контроля). Посев инкубирован 37°С в течение суток. Контрольные культуры выделяют токсин, который диффундирует в агар и взаимодействует с антителами, которые тоже диффундируют в агар из фильтровальной бумажки, в месте их соединения в среде образуется преципитат в виде белых линий – «усов». Такие же линии образовались около испытуемой культуры, следовательно, она образует токсин.

Методические указания к практической работе

Реакция преципитации основана на осаждении коллоидного раствора антигена антителами иммунной сыворотки в присутствии электролита.

Антиген, участвующий в реакции преципитации, получил название преципитиногена. Он представляет собой вещества (белки, липиды, полисахариды, липополисахариды и др.), извлеченные из микробных клеток, тканей животных и человека, исследуемого материала, находящиеся в коллоидном состоянии, в виде прозрачного или слегка опалесцирующего раствора. Получают преципитиноген, используя различные методы экстракции веществ из клеток и тканей: растирание с песком или стеклянным порошком с последующей фильтрацией для освобождения от обломков и целых клеток: разрушение путем встряхивания, замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, химическими, биологическими воздействиями, путем электролиза.

Антитела называют преципитинами. Получат преципитины путем гипериммунизации животных (кроликов, коз, баранов и др.) полноценными антигенами, живыми или убитыми микробными клетками, токсинами, анатоксинами, животными и растительными белками. У полученной сыворотки определяют титр. Под титром преципитирующей сыворотки понимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование осадка, который называют преципитатом (комплекс антиген + антитело).

Реакция преципитации протекает в две фазы. В первой происходит соединение коллоидного антигена с антителами, во второй фазе осаждение (преципитация) образовавшихся комплексов в виде помутнения в присутствии электролита.

Реакция преципитации применяется для:

1) определения видовой принадлежности антигена: а) бактерии и других микроорганизмов - индикация и идентификация неизвестных микроорганизмов в объектах внешней среды, патологическом материале или чистой культуре; б) животных и человека – определение видовой принадлежности продуктов, белковых пятен и тому подобное в судебно-медицинской практике, санитарии; 2) для обнаружения специфических антител с исследуемой сыворотке с помощью известного преципитиногена.

Реакция преципитации характеризуется высокой чувствительностью, так как позволяет обнаружить очень малые количества антигена.

Реакцию можно поставить разными методами.

1) Преципитация в растворах – это наиболее простой метод постановки. В целом он служит для определения антигена. Растворимый антиген в разных разведениях добавляют к преципитирующей сыворотке, цельной или разведенной в два раза, смесь помещают в термостат для инкубирования до суток. Реакцию оценивают макроскопически по появлению мути. Более точен учет с помощью нефелометрии.

Особую форму преципитации в растворе представляет метод кольцепреципитации, при котором на преципитирующую сыворотку, налитую в пробирку, осторожно, так чтобы жидкости не перемешивались, наслаивают равный объем преципитиногена. При соответствии антигена антителу на границе жидкостей появляется тонкое кольцо преципитата. Степень положительной реакции определяют по выраженности кольца и времени его появления.

2) Преципитация в геле

Преципитация в геле основана на способности растворимых антигенов и антител диффундировать в агар (гель), образующиеся же иммунные комплексы (преципитат) в виду их большой величины не диффундируют, а остаются на месте образования в виде линий или полос. Если диффундирует один компонент (антиген или антитело), то иммунодиффузия называется простой, если оба (и антиген и антитело) – то двойной. Если диффузия происходит по одной оси, то она называется линейной. Если вещества диффундируют во все стороны (из резервуара в среду) радиально – радиальной.

Схема 9

Реакция преципитации