Существуют и другие модификации постановки непрямой реакции иммунофлюоресценции, в частности, антикомплементарный. Сущность его заключается в том, что на первом этапе, кроме диагностических, антител в реакцию вводят комплемент. При идентичности антигена и антитела образуется иммунный комплекс, на котором адсорбируется комплемент. На втором этапе препарат обрабатывают антикомплементарной флюоресцирующей сывороткой, антитела которой присоединятся к комплексу, образовавшемуся на первом этапе реакции. Этот иммунный комплекс будет светиться при исследовании препарата в люминесцентном микроскопе.
Метод иммунофлюоресценции применяют для: 1) индикации и идентификации гетеро- и аутоантигенов (бактерий, вирусов, грибов); 2) доказательства выработки антител определенной специфичности (выявление антител к ДНК, тканевому антигену щитовидной железы); 3) доказательства реакции антиген+антитело в тканях (при сывоточной болезни, гломерулонефрите и т.п.); 4) выявления антител в сыворотке крови.
Радиоиммунный метод
Для метки антигена или антитела используют радиоактивные изотопы 125J, 131J, 3H, 14C. Применение радиоактивной метки возможно, если меченные антигены и антитела сохраняют способность взаимодействовать друг с другом. Метод более чувствителен, чем предыдущий, точен при количественной оценке антигена или антитела.
Реакцию учитывают путем измерения радиоактивности в образовавшемся комплексе антиген+антитело. При постановке реакции используют модификации:
А) Классический радиоиммунный метод. Метод основан на конкуренции за антитело между меченным стандартным антигеном и немеченым антигеном, содержащимся в исследуемом материале.
К исследуемому материалу добавляют стандартную дозу антитела, а затем спустя некоторое время добавляют дозу меченного антигена. Часть антител вступит во взаимодействие с исследуемым антигеном и свяжется с ним, а часть антител будет взаимодействовать с меченным антигеном. Чем больше концентрация антигена в исследуемом материале, тем больше антител уйдет на взаимодействие с ним, тем меньше останется антител для соединения с меченым антигеном, тем выше концентрация свободного меченого антигена в растворе.
Для количественного определения антигена комплекс осаждают и отделяют от свободного антигена, радиоактивность подсчитывают в счетчике, строят график и оценивают количество антигена.
Эта модификация нашла широкое применение не только при решении иммунологических проблем, с ее помощью можно обнаружить минимальные количества некоторых веществ в биологических жидкостях, например, инсулина.
Б) Техника «твердая фаза». В данной модификации антиген или антитело адсорбируют на поверхности полимеров: полистирола, полиэтилена, сефадекса и др. В зависимости от характера реакции различают следующие методы:
1) методы, основанные на конкуренции антигенов. Принцип метода заключается в том, что определяемый и меченный антигены конкурируют за антитела известной концентрации, осажденные на сорбенте. Чем больше антигена содержится в исследуемом материал, тем больше антител с ним свяжется, тем меньше меченого антитела будет на субстрате. На этом принципе основано определение IgЕ, ряда гормонов, лекарственных веществ.
2) неконкурентные методы. Принцип заключается во взаимодействии антигена (или антитела) и антителами (или антигенами) известной специфичности, адсорбированными на сорбенте, после чего к ним добавляют меченые антиглобулины и после инкубации определяют содержание радиоактивных реагентов. Данный тест в практике используется для определения HBs-антигена.
3) «Сандвич-метод» представляет собой модификацию «неконкурентных» методов. Принцип заключается в инкубации определенного антигена с антителами к нему, после отмывания не связавшихся антител, смесь обрабатывают соответствующей меченой антисывороткой, после чего оценивают количество антигена с помощью счетчика. Этим методом можно обнаружить содержание IgЕ, антигена гепатита В, антигенов гистосовместимости, антител к ДНК.
Особой формой метода является авторадиография, заключающаяся в обработке срезов тканей мечеными антителами известной специфичности. Метод позволяет определить локализацию антигена, например, мембранных рецепторов лимфоцитов.
Иммуноферментный метод
Этот метод был предложен для замены радиоактивного маркера после того, как появились сообщения о возможности присоединения фермента к белкам и количественного учета активности фермента. Метод получил название ферментиммуносорбентного или иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA).
Разработаны различные варианты метода в зависимости от вида фермента и системы антиген – антитело. В качестве ферментных меток применяют щелочную фосфатазу, пероксидазу из хрена, β-галактозидазу.
Для количественного анализа применяют две модификации ИФА. В обоих случаях первым этапом является связывание специфических антител на твердом субстрате, обычно на стенке пластиковой пробирки. Связывание происходит за счет адсорбции белка на гидрофобной поверхности пробирки.
В первой модификации антиген, меченный ферментами, конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за связывание с антителами и ферментная активность обратно пропорциональна количеству антигена в исследуемом материале. Во второй модификации конкурентные отношения отсутствуют.
Для определения антител известный антиген фиксируют на твердом носителе. Добавляют исследуемую сыворотку. Инкубируют, после чего свободные антитела отмывают и удаляют. Препарат обрабатывают антиглобулиновой сывороткой, меченой ферментом. Опять отмывают от свободных антител. Затем, чтобы определить присутствие фермента, добавляют специфический реактив, который изменит цвет. Учитывают активность фермента колориметрически и рассчитывают количество антител, которое будет пропорционально активности фермента.
Для измерения количества антигена на поверхности полистироловой пластины фиксируют специфическое антитело. К нему добавляют пробу с исследуемым антигеном. Оставляют для взаимодействия. После отмывания и удаления свободного антигена в лунки добавляют ту же сыворотку, но меченую ферментом. Инкубируют, удаляют отмыванием свободные антитела, добавляют субстрат и колориметрически определяют активность фермента. По результатам рассчитывают количество антигена.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.